劉佳慶張 立孫海柏吳 敏杜巖青馮 爽 劉樹業(yè)

新技術(shù)交流

液態(tài)芯片技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)IFN-γ和IP-10診斷結(jié)核性胸腔積液

劉佳慶1,2張 立1孫海柏1吳 敏1杜巖青1馮 爽1劉樹業(yè)2△

目的 應(yīng)用液態(tài)芯片技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)胸腔積液中干擾素（IFN）-γ、IFN-γ誘導(dǎo)蛋白（IP）-10水平，探討其在臨床快速診斷及鑒別診斷結(jié)核性胸腔積液中的應(yīng)用價(jià)值。方法選取滲透性胸腔積液患者，其中結(jié)核性胸腔積液組52例；惡性胸腔積液組38例。利用結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）測(cè)定其對(duì)結(jié)核桿菌反應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量，即斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)（SFCs），同時(shí)利用液態(tài)芯片技術(shù)測(cè)定其IFN-γ和IP-10水平，通過Logistic逐步回歸法評(píng)估IFN-γ和IP-10聯(lián)合診斷時(shí)的價(jià)值，并比較兩種診斷方法的價(jià)值。結(jié)果T-SPOT.TB法診斷結(jié)核性胸腔積液的靈敏度為90.38％，特異度為84.21％，ROC曲線下面積（AUC）及95％CI為0.938(0.867～0.978)；IFN-γ、IP-10聯(lián)合診斷結(jié)核性胸腔積液時(shí)的靈敏度為98.08％，特異度為97.37％，AUC及95％CI為0.995（0.951～1.000）。2種診斷方法靈敏度和特異度的差異不明顯；2種方法診斷一致性良好（Kappa=0.703）；方法間AUC比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.996，P＜0.05），檢測(cè)IFN-γ、IP-10水平聯(lián)合診斷時(shí)AUC較大（AUC=0.995）。結(jié)論利用液態(tài)芯片技術(shù)同時(shí)檢測(cè)IFN-γ、IP-10水平聯(lián)合診斷結(jié)核性胸腔積液滿足了臨床快速、準(zhǔn)確診斷及鑒別診斷結(jié)核性胸腔積液的需要。

干擾素Ⅱ型；趨化因子CXCL10；胸腔積液,惡性；結(jié)核；ROC曲線；結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)；液態(tài)芯片；IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10

我國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，≥15歲人口中活動(dòng)性肺結(jié)核患者高達(dá)499萬[1]。在控制結(jié)核病各個(gè)環(huán)節(jié)中，準(zhǔn)確診斷和早期治療非常重要，結(jié)核感染相關(guān)的干擾素（IFN）-γ釋放試驗(yàn)將可能成為強(qiáng)有力的高靈敏度和高特異度的結(jié)核診斷輔助工具[2]。本研究利用液態(tài)芯片技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)胸腔積液中IFN-γ和IFN-γ誘導(dǎo)蛋白（IP）-10水平并與經(jīng)典的結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）方法進(jìn)行比較，以尋求早期快速準(zhǔn)確診斷結(jié)核性胸腔積液的策略。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取我院2012年6月—2013年6月胸腔積液患者90例。其中結(jié)核組52例，男33例，女19例，平均年齡（49.02±21.99）歲，入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）有結(jié)核病的中毒癥狀，如發(fā)熱、盜汗、全身乏力、食欲減退等。（2）經(jīng)過抗結(jié)核治療后，病情好轉(zhuǎn)，治療有效。（3）胸膜活檢時(shí)可見結(jié)核結(jié)節(jié)。（4）純化蛋白衍生物試驗(yàn)（PPD）結(jié)節(jié)大于1.5 cm×1.5 cm。（5）經(jīng)肺部X線平片或CT檢查證實(shí)有結(jié)核病灶。以上5項(xiàng)中符合3項(xiàng)或單項(xiàng)（3）均可。惡性組38例，男27例，女11例，平均年齡（52.89±20.20）歲，入組標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)肺穿刺活檢、胸部CT、脫落細(xì)胞學(xué)或纖維支氣管鏡檢查獲得病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)依據(jù)而確診為惡性胸腔積液患者。2組人群排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠期或哺乳期婦女。（2）年齡＜16歲或＞90歲。（3）正規(guī)抗結(jié)核治療超過1周。2組年齡（t=0.854）、性別（χ2=0.279）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 儀器和試劑 IFN-γ和IP-10聯(lián)合檢測(cè)試劑盒購于美國伯樂公司；Luminex 200多功能流式點(diǎn)陣儀購于美國Luminex公司；T-SPOT.TB試劑盒購于英國Oxford Immunotec公司。

1.3 方法 所有患者留取新鮮胸腔積液約50 mL，及時(shí)送實(shí)驗(yàn)室，取部分裝于5 mL離心管中，以10 000×g離心10 min后取上清液1 mL放入1.5 mL離心管中，置-20℃冰箱中保存，余下胸腔積液立即利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISPOT）檢測(cè)結(jié)核感染T細(xì)胞數(shù)量（T-SPOT.TB法），以2種抗原分別刺激所得的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)（SFCs）較大者為T-SPOT.TB結(jié)果，臨界值為SFCs=6；利用液態(tài)懸浮芯片技術(shù)（Luminex xMAP?）同時(shí)檢測(cè)IFN-γ和IP-10水平，利用ROC曲線確定臨界值。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書和本科室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）文件執(zhí)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布計(jì)量資料采用±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料采用M(P25,P75)表示，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；陽性率的比較采用配對(duì)資料的McNemar檢驗(yàn)；多因素分析采用Binary Logistic回歸；應(yīng)用Medcalc 11.4軟件繪制ROC曲線，比較曲線下面積(AUC)，確定臨界值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組胸腔積液中IFN-γ、IP-10水平及SFCs比較 結(jié)核組胸腔積液中IFN-γ、IP-10水平及SFCs高于惡性組(均P＜0.01)，見表1。

Tab.1 Comparison of pleural effusion levels of IFN-γ, IP-10 and SFCs between two groups表1 2組胸腔積液中IFN-γ、IP-10、SFCs水平比較[M(P25,P75)]

2.2 ROC曲線分析 利用ROC曲線確定IFN-γ、IP-10的診斷臨界值分別為68.12、86.68 ng/L，靈敏度分別為90.38％、94.23％，特異度分別為92.11％、94.74％，AUC及95％CI分別為0.965(0.903～0.992)、0.962(0.899～0.991)，見圖1。

Fig.1 Comparison of ROC curves between two diagnostic tests圖1 2種診斷試驗(yàn)ROC曲線圖比較

2.3 Binary Logistic回歸分析 利用Logistic逐步回歸法計(jì)算出IFN-γ、IP-10聯(lián)合檢測(cè)時(shí)的回歸方程為：Log(P)=0.018×IFN-γ+0.020×IP-10-4.558 (P為預(yù)測(cè)因子)，經(jīng)轉(zhuǎn)換得到預(yù)測(cè)因子的方程P=1/(1+e-(0.01819×IFN-γ+0.01963×IP-10-4.558))，以P作為聯(lián)合診斷指標(biāo)繪制的ROC曲線見圖1，靈敏度和特異度分別為98.08％、97.37％，AUC及95％CI為0.995(0.951～1.000)。

2.4 2種方法比較 T-SPOT.TB診斷結(jié)核性胸腔積液 ROC曲線見圖 1，靈敏度和特異度分別為90.38％、84.21％，與IFN-γ、IP-10聯(lián)合診斷時(shí)的靈敏度和特異度比較差異不明顯；AUC及95％CI為0.938(0.867～0.978)，與IFN-γ、IP-10聯(lián)合診斷時(shí)的AUC比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.996，P＜0.05)，聯(lián)合診斷時(shí)的AUC較大。2種診斷方法的診斷一致性良好（Kappa=0.703）。

3 討論

滲出性胸腔積液在臨床上以結(jié)核性和惡性最為多見，兩者治療和預(yù)后迥然不同，故正確鑒別非常重要。IFN-γ是1型輔助性T淋巴細(xì)胞亞群（Th1）的特征性細(xì)胞因子，結(jié)核菌感染后，病變部位巨噬細(xì)胞被活化，IFN-γ產(chǎn)生增加，進(jìn)而胸腔積液中IFN-γ表達(dá)增高。IP-10由IFN-γ和（或）脂多糖（LPS）誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有促進(jìn)多種細(xì)胞因子分泌介導(dǎo)Th1型炎癥反應(yīng)及抗結(jié)核等生物學(xué)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)惡性胸腔積液中IFN-γ水平顯著低于結(jié)核性胸腔積液，與最近類似報(bào)道的結(jié)果[3-4]一致。但上述類似報(bào)道中IFN-γ的測(cè)定均使用傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法，操作繁瑣，重復(fù)性差，易受自身抗體及嗜異性抗體等因素干擾，而且擴(kuò)展性差，不能多指標(biāo)并行檢測(cè)，本研究所用的液態(tài)芯片技術(shù)改變了ELISA的分析模式，是多功能、多指標(biāo)的并行分析系統(tǒng)，集編碼微球、激光技術(shù)、流式細(xì)胞、數(shù)字信號(hào)處理等技術(shù)于一體，具有高通量、高效率的特點(diǎn)，在孵育時(shí)間、標(biāo)本用量、檢測(cè)線性范圍、檢測(cè)低限等方面均優(yōu)于ELISA法，而且在聯(lián)合指標(biāo)的選擇上具有非常大的靈活性，可以自行設(shè)計(jì)，隨意組合多指標(biāo)并行檢測(cè)，節(jié)省了時(shí)間和成本。最近有研究利用ELISA方法測(cè)定胸腔積液中IFN-γ等多指標(biāo)組合后診斷結(jié)核性胸腔積液，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合診斷時(shí)得到最高的靈敏度和特異度[5-6]。本研究選擇聯(lián)合檢測(cè)胸腔積液中IFN-γ和IP-10水平，結(jié)果高于IFN-γ單獨(dú)檢測(cè)時(shí)的診斷效率，成本也顯著低于IFN-γ和IP-10兩種ELISA試劑的價(jià)格之和。聯(lián)合檢測(cè)與經(jīng)典的T-SPOT.TB方法比較時(shí)，兩者診斷一致性良好（Kappa=0.703），盡管靈敏度和特異度的差異不明顯，但是兩者AUC比較表明IFN-γ、IP-10聯(lián)合診斷時(shí)對(duì)結(jié)核性胸腔積液的診斷價(jià)值更高，并且TSPOT.TB方法樣本需要量大，操作繁瑣，等待時(shí)間長（2 d）。另有研究表明，與T-SPOT.TB同屬經(jīng)典IFN-γ釋放試驗(yàn)（IGRAs）的TB.QFT-IT(QuantiFERON-TB Gold in Tube)用于診斷結(jié)核性胸腔積液也不如IFN-γ水平直接定量測(cè)定價(jià)值高，TB.QFT-IT只增加了醫(yī)療費(fèi)用沒有提高診斷價(jià)值[7]。

本研究利用液態(tài)芯片技術(shù)多指標(biāo)并行的優(yōu)勢(shì)聯(lián)合檢測(cè)IFN-γ、IP-10診斷結(jié)核性胸腔積液，操作簡單，報(bào)告時(shí)間短，而且靈敏度、特異度均較高，滿足了輔助臨床對(duì)結(jié)核性胸腔積液早期準(zhǔn)確診斷的需要。但是由于類似研究的缺少，沒有推薦的臨界值及醫(yī)學(xué)決定水平，而且本研究的標(biāo)本均來自于同一家醫(yī)院，其代表性有一定局限性，樣本量較小，也不能排除在結(jié)核性胸腔積液患者中有非結(jié)核分枝桿菌感染，雖然這種現(xiàn)象很少見[8]，因此，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量繼續(xù)深入研究。

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（2013-12-14收稿 2014-04-25修回）

（本文編輯 李國琪）

Diagnostic Value of Combined Detection of the Level of IFN-γ and IP-10 by Liquid Array Technology in Tuberculous Pleural Effusion

LIU Jiaqing1,2,ZHANG Li1,SUN Haibai1,WU Min1,DU Yanqing1,FENG Shuang1,LIU Shuye2△
1 Tianjin Haihe Hospital,Tianjin 300350,China;2 The Third Central Clinical School of Tianjin Medical University△

E-mail:lshye@163.com

ObjectiveTo explore the diagnostic value of combined detection of the liquid array technology,interferon(IFN)-γ and IFN-γ-inducible protein(IP)-10 in the rapid,accurate diagnosis and differential diagnosis of tuberculous pleural effusions.MethodsPatients with transudative pleural effusions were divided into tuberculous pleural effusion group(n=52)and malignant pleural effusion group(n=38).The method of T-SPOT.TB was used to detect the number of effector T cells sensitized to Mycobacterium tuberculosis and spot forming cells(SFCs).The liquid array technology was used to detect the level of IFN-γ and IP-10.Logistic regression was used to analyze and compare the diagnostic value of the twomethod combination.ResultsThe diagnostic sensitivity,specificity and the area under the ROC curve(AUC)of T-SPOT. TB were 90.38％,84.21％,and 0.938(95％CI:0.867-0.978),respectively.The diagnostic sensitivity,specificity and AUC of combined detection of IFN-γ and IP-10 were 98.08％,97.37％,and 0.995(95％CI:0.951-1.000),respectively.There was no significant difference in the diagnostic sensitivity and specificity between the two methods,and the diagnostic agreement for the two diagnostic methods was fine(Kappa=0.703).The difference of AUC between the methods was significantly different(Z=1.996,P＜0.05).The method of combined detection of IFN-γ and IP-10 showed the larger AUC(AUC=0.995).Conclusion The combined diagnosis meets the clinical needs of rapid,accurate diagnosis and differential diagnosis for tuberculous pleural effusion by simultaneously assaying the level of IFN-γ and IP-10 using the liquid array technology.

interferon typeⅡ;chemokine CXCL10;pleural effusion,malignant;tuberculosis;ROC Curve; T-SPOT.TB;liquid array technology;IFN-γ-inducible protein 10

R521

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.027

天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目(2013KZ042)

1天津市海河醫(yī)院檢驗(yàn)科(郵編300350)；2天津醫(yī)科大學(xué)三中心臨床學(xué)院

△通訊作者 E-mail:lshye@163.com