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三七有效成分對免疫性肝損傷的保護(hù)作用

韋 維1黃永秩2梁柳丹1農(nóng)鳳映1農(nóng)超鵬1李 韜1△

目的 研究三七有效成分三七總皂苷、總黃酮及多糖對小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用。方法昆明種小鼠60只隨機(jī)分為正常組（A組）、模型組（B組）、三七總皂苷組（C組）、三七總黃酮組（D組）、三七多糖組（E組）。C、D、E組分別給予三七總皂苷、三七總黃酮、三七多糖灌胃，1次/d，14 d后B、C、D和E組于尾靜脈注射卡介苗，26 d于尾靜脈注射脂多糖，禁食12 h后于眼球靜脈叢采血，檢測血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）的含量；取肝、脾、胸腺計(jì)算臟器指數(shù)；另取肝臟做病理學(xué)檢查。結(jié)果與B組比較，C、D、E組小鼠肝、脾、胸腺指數(shù)、血清ALT水平明顯降低（P＜0.01），IL-4、T-SOD顯著升高（P＜0.01）；病理學(xué)示C、D、E組肝臟炎癥細(xì)胞浸潤、水腫和點(diǎn)狀、片狀壞死程度均比B組明顯減輕。結(jié)論三七總皂苷、總黃酮及多糖對免疫性肝損傷均有明顯的保護(hù)作用。

三七皂甙；卡介苗；脂多糖類；三七總黃酮；三七多糖；免疫性肝損傷

三七為五加科植物參三七的根，含皂苷類、黃酮類、多糖類、醇類及三七素等有效成分。三七的藥理作用非常廣泛，具有止血、活血化瘀、降血脂、降血壓、抗衰老、抗炎、抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫等作用。實(shí)驗(yàn)表明，三七總皂苷具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫、體液免疫和自然殺傷（NK）細(xì)胞功能的作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)三七提取活性成分Rh2、Rg3能夠保護(hù)荷瘤小鼠的免疫器官并增強(qiáng)免疫功能，提高荷瘤小鼠的免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌[2]。而有關(guān)三七的其他活性成分對肝組織細(xì)胞的免疫損傷作用尚少見相關(guān)報(bào)道。本研究通過卡介苗（BCG）聯(lián)合脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷模型，觀察三七有效成分三七總皂苷、總黃酮及多糖對小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明種小鼠60只，體質(zhì)量20～25 g，雌性，清潔級，購自右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房，動(dòng)物許可證號：syxk桂2011-0010。三七粉（云南向輝生物科技有限公司），按文獻(xiàn)[3-5]分別醇提三七總皂苷、醇提三七總黃酮、水提三七多糖。BCG購于成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，LPS購于美國sigma公司，白細(xì)胞介素（IL）-4試劑盒（96T）購于美國R＆D公司，血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑購于南京建成生物工程研究所，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑購于四川邁克生物科技股份有限公司。722可見光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），Tristar-LB941多功能酶標(biāo)儀（德國伯托公司），HH·W21·600S數(shù)顯電熱恒溫水溫箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），TGL-18G-C高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），組織包埋機(jī)（德國美康公司），Primo star生物顯微鏡（德國卡爾·蔡司公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 將60只雌性小鼠用數(shù)字表隨機(jī)分為正常組（A組）、模型組（B組）、三七總皂苷組（C組）、三七總黃酮組（D組）和三七多糖組（E組），每組12只。C、D、E組分別給予三七總皂苷、三七總黃酮、三七多糖（400 mg·kg-1·d-1）灌胃，A組和B組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2.2 造模及處理 給藥14 d后，B、C、D和E組于尾靜脈注射BCG 0.2 mL（12.5 mg/kg，約含5×107個(gè)活菌）。26 d后再于尾靜脈注射LPS 7.5 μg/只（0.2 mL）。禁食不禁水12 h后稱體質(zhì)量，經(jīng)眼眶后靜脈叢采血，脫臼處死，立即取肝臟、脾臟和胸腺。計(jì)算臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×100％。取相同部位及大小的肝組織小塊，放入10％福爾馬林溶液中固定，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。采血后室溫放置30 min，3 500 r/min離心5 min，取血清測定ALT、IL-4和T-SOD含量，按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，LSD-t法進(jìn)一步做兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠臟器指數(shù)比較 B組體質(zhì)量低于A組，而肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯高于A組；且C、D及E組的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯低于B組（均P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of organ index between five groups of mice表1 各組小鼠臟器指數(shù)比較 （n=12，±s）

Tab.1 Comparison of organ index between five groups of mice表1 各組小鼠臟器指數(shù)比較 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與A組比較，b與B組比較，P＜0.01

組別A組B組C組D組E組F體質(zhì)量（g）32.870±2.250 30.508±2.094a32.975±2.525 33.950±3.274 28.373±1.505 10.529＊＊肝臟指數(shù)（mg/g）4.591±0.382 5.246±0.095a4.729±0.192b4.636±0.120b4.702±0.313b9.027＊＊組別A組B組C組D組E組F脾臟指數(shù)（mg/g）0.371±0.177 0.506±0.121a0.410±0.059b0.424±0.051b0.425±0.041b17.648＊＊胸腺指數(shù)（mg/g）0.328±0.072 0.392±0.075a0.281±0.093b0.288±0.081b0.301±0.082b16.604＊＊

2.2 各組小鼠血清ALT、IL-4、T-SOD含量比較 B組的ALT高于A組，IL-4、T-SOD低于A組；C、D、E組的血清ALT低于B組，IL-4、T-SOD水平高于B組（均P＜0.01），見表2。

Tab.2 Comparison of serum levels of ALT,IL-4 and T-SOD between five groups of mice表2 各組小鼠血清ALT、IL-4和T-SOD水平比較（n=12，±s）

Tab.2 Comparison of serum levels of ALT,IL-4 and T-SOD between five groups of mice表2 各組小鼠血清ALT、IL-4和T-SOD水平比較（n=12，±s）

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2.3 小鼠肝臟肉眼觀察 B組肝臟腫大，表面有大小不等的壞死斑點(diǎn)。C、D及E組肝臟腫大較輕，壞死斑較B組輕。A組肝臟表面光滑未見腫大和壞死斑點(diǎn)。

2.4 肝組織病理學(xué)檢查 與B組相比，C、D和E組肝組織炎癥細(xì)胞浸潤、水腫、壞死程度及纖維增生均明顯減輕，見圖1。

3 討論

目前BCG+LPS聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫性肝損傷的動(dòng)物模型是研究臨床肝炎發(fā)病和治療較理想的動(dòng)物模型[6]，BCG與LPS聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫性肝損，其病理改變與肝細(xì)胞損傷機(jī)制和乙型病毒性肝炎相類似，其病理組織學(xué)的特征損傷是肝壞死和大量的單核細(xì)胞浸潤[7]。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠尾靜脈注射BCG+LPS造模后，病理組織觀察肝細(xì)胞嚴(yán)重水腫、壞死，匯管區(qū)及周圍大量炎性細(xì)胞浸潤，證明BCG+LPS所造成的小鼠免疫性肝炎模型獲得成功。采用三七總皂苷、三七總黃酮和三七多糖灌胃后，肝組織病理觀察顯示肝細(xì)胞腫脹、壞死，匯管區(qū)及周圍大量炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象明顯減輕，說明三七總皂苷、三七總黃酮和三七多糖均可對小鼠免疫性肝損傷具有保護(hù)作用。

免疫器官指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的初歩指標(biāo)，在一定程度上可反映免疫器官內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，肝臟指數(shù)可反映肝臟的損傷及炎癥程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示給予三七總皂苷、三七總黃酮和三七多糖灌胃后能明顯降低小鼠肝、脾、胸腺指數(shù)，說明三七能抑制炎性介質(zhì)的分泌。

IL-4是Th2細(xì)胞自身分泌的生長因子，對于B細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和造血細(xì)胞都有免疫調(diào)節(jié)作用[8]。本實(shí)驗(yàn)中B組血清IL-4水平較A組明顯降低，說明Th2細(xì)胞活性受到抑制，而C、D、E組給藥后IL-4含量顯著增高，說明Th2細(xì)胞活性受抑制得到緩解，結(jié)果表明三七總皂苷、三七總黃酮和三七多糖具有不同程度的調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞分泌的功能。

活性氧自由基引發(fā)的氧化應(yīng)激是肝病發(fā)病的共同病理生理基礎(chǔ)，因此，對氧化應(yīng)激導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的研究便成為治療肝臟疾病的一個(gè)重要途徑[9]，SOD對氧自由基有清除作用，可保護(hù)細(xì)胞免受損傷。BCG+LPS所致的小鼠免疫性肝損傷過程中可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)產(chǎn)生大量氧自由基，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組T-SOD活性比A組顯著降低，而C、D、E組用藥后血清T-SOD活性顯著升高，表明機(jī)體抗氧化能力增強(qiáng)，加速自由基的清除。此外，B組血清ALT含量明顯升高，而C、D、E組血清ALT含量顯著降低，說明給藥組肝臟受損傷程度減輕。

綜上，三七總皂苷、三七總黃酮和三七多糖對免疫性肝損傷均有不同程度的保護(hù)作用，三者作用無明顯差異。

Fig.1 Pathological images of liver tissues in five groups of mice（HE，×200）圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)觀察（HE，×200）

[1] 劉艷娥，劉麗麗，房國濤.三七抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究概況[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19（4）：1015-1016.

[2]李元青，馬成杰，陳信義，等.三七活性成分抗腫瘤作用及其免疫學(xué)機(jī)制初探[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)（中醫(yī)臨床版）,2008，15 （1）：17-19.

[3]索建蘭，沈峰，米海林.三七總皂苷提取工藝的研究[J].藥物分析雜志，2011，31（6）：1197-1198.

[4]王津江，陳磊，宋洪濤，等.白背三七總黃酮的提取工藝研究[J].中國藥師，2009，12（2）：146-149.

[5]盛卸晃，王健，郭建軍，等.三七多糖的分離純化及理化性質(zhì)研究[J].中草藥，2007，7（38）：987-989.

[6]黃凱，楊新波，陳紅艷，等.兩種急性免疫性肝損傷小鼠模型的對比研究[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（11）：31-34.

[7]宋雨鴻,劉強(qiáng)，徐舒，等.丹參多糖對小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用[J].中南藥學(xué)，2013，11（5）：345-348.

[8]金伯泉，熊思東.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：88-107.

[9]周燕，翟羽佳，何蓉蓉，等.荊條子乙醇提取物對小鼠免疫性肝炎及急性炎癥的影響［J］.中國中藥雜志，2011，36(17):2404-2408.

（2014-02-17收稿 2014-04-20修回）

（本文編輯 閆娟）

Protective Effects of Active Ingredients of Notoginseng on Immunological Liver Injury

WEI Wei1,HUANG Yongzhi2,LIANG Liudan1,NONG Fengying1,NONG Chaopeng1,LI Tao1△
1 Youjiang Medical College for Nantionalities,Guangxi 533000,China;2 Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities
△

E-mail:lili0841@qq.com

ObjectiveTo investigate the protective effects of active components of notoginseng on immunological liver injury in mice.MethodsSixty Kunming mice were randomly divided into normal group(group A),model group (Group B),PNS group(Group C),total flavonoids group(Group D),and polysaccharide group(group E).C,D and E groups were given PNS,total flavonoids and polysaccharide orally,1/day for 14 days.Then BCG was intravenous injected in B,C,D and E groups,and after 26 days lipopolysaccharide(LPS)was intravenous injected.Samples of eye venous plexus blood were collected,and serum levels of alanine aminotransferase(ALT),total superoxide dismutase(T-SOD)and Interleukin-4(IL-4) were detected.Organs index was calculated by checking pathological resultsof liver,spleen and thymus.ResultsCompared with group B,the thymus index and serum ALT levels were significantly decreased in C,D and E groups(P＜0.01), but the levels of IL-4 and T-SOD increased significantly(P＜0.01).Pathological resultsshowed that there were more serious inflammatory cell infiltration in liver,edema and necrosis of dot in C,D and E groups than those in group B.ConclusionThe active components of notoginseng showed a significant protective effect on immunological liver injury.

sanchinoside；BCG vaccine；lipopolysaccharides；total flavonoids；polysaccharide；immune liver injury

R285.5

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.011

廣西壯族自治區(qū)2013年度自治區(qū)級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（QJCX201347）

1右江民族醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院（郵編533000）；2右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

△通訊作者 E-mail:lili0841@qq.com