周黎明 卜賀啟 劉殿雷 金海敏 周蒙滔

冬凌草甲素聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌SW1990細胞抑制作用的研究

周黎明1，2卜賀啟3劉殿雷2金海敏2周蒙滔1△

目的 探討冬凌草甲素在體外聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細胞株SW1990抑制作用及其可能機制。方法不同濃度的冬凌草甲素（0、10、20、40、80、160 μmol/L）作用胰腺癌SW1990細胞24、48、72 h后，CCK-8法檢測胰腺癌細胞株SW1990細胞的增殖作用；冬凌草甲素（40 μmol/L）與吉西他濱（20 μmol/L）單獨及聯(lián)合處理細胞48 h，并設(shè)立對照組,CCK-8法檢測SW1990細胞的存活率；Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況；RTPCR檢測SW1990細胞中NF-κB和XIAP基因的表達水平。結(jié)果冬凌草甲素對胰腺癌SW1990細胞的增殖抑制作用呈明顯的劑量與時間依賴性；與其他各組相比，冬凌草甲素聯(lián)合吉西他濱組細胞存活率明顯降低（P＜0.05），凋亡率顯著升高（P＜0.05）；另外，聯(lián)合組明顯下調(diào)胰腺癌細胞中NF-κB和XIAP表達水平（P＜0.05）。結(jié)論冬凌草甲素在體外能顯著增強吉西他濱對胰腺癌SW1990細胞的抗瘤效果，其機制可能是通過下調(diào)NF-κB及其下游XIAP的表達，進而誘導(dǎo)胰腺癌細胞的凋亡而實現(xiàn)。

胰腺腫瘤；細胞系,腫瘤；冬凌草素；細胞凋亡；NF-κB；XIAP；吉西他濱

冬凌草甲素是從唇形科Labtea香茶菜屬Rabdosi提取出來的一種二萜類化合物，相關(guān)研究已報道其有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種藥理學(xué)效應(yīng)[1]。關(guān)于其抗腫瘤活性，已有研究證實冬凌草甲素對肝癌、鼠纖維肉瘤L929、結(jié)直腸癌、胰腺癌等多種惡性細胞能產(chǎn)生非常顯著的抑制效應(yīng)及細胞毒性作用[2-5]。近年來中醫(yī)藥的聯(lián)合用于抗癌研究受到極大關(guān)注，有研究表明，白藜蘆醇等藥物聯(lián)合吉西他濱能顯著抑制胰腺癌細胞增殖[6]。本研究以胰腺癌細胞SW1990為研究對象，觀察冬凌草甲素聯(lián)合吉西他濱對細胞生長及凋亡的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 冬凌草甲素（純度＞98％），購于北京環(huán)宇生物技術(shù)有限公司，用DMSO配制成10 mmol/L（DMSO的終濃度小于0.1％），-20℃冰箱保存。吉西他濱（法國禮來公司）用無菌生理鹽水配成0.2 mmol/L。胎牛血清、胰酶、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）。CCK-8試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)研究所）。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物發(fā)展有限公司）。TRIzol試劑及cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) 人胰腺癌細胞SW1990（購于ATCC）培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于含5％CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。細胞單層貼壁生長，至70％～80％融合時胰蛋白酶消化傳代。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖 收集處于對數(shù)生長期的SW1990細胞，以每孔5×103個細胞接種到96孔板，細胞貼壁后，加入不同濃度(10、20、40、80、160 μmol/L)的冬凌草甲素，分別培養(yǎng)24、48、72 h；以及加入吉西他濱（20 μmol/L），冬凌草甲素（40 μmol/L）及兩藥聯(lián)合培養(yǎng)48 h；每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照調(diào)零組（不加細胞加入等量的培養(yǎng)液），并設(shè)對照組（加入等量含有0.1％DMSO的培養(yǎng)液）。藥物作用結(jié)束前1 h，各孔加入0.01 mL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀（Bio-Tek，ELX800）測A450值，實驗重復(fù)3次。

細胞抑制率=［1－（實驗組－空白調(diào)零組）/（對照組－空白調(diào)零組）］×100％。藥物的相互作用按照Chou-Talalay方法計算聯(lián)合指數(shù)（combination index,CI）,CI=1為兩藥物作用相加，CI＜1為協(xié)同作用，CI＞1為拮抗作用。

1.4 流式細胞術(shù)檢測凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。將4×105個處于對數(shù)生長期的SW1990細胞接種在6孔培養(yǎng)板中，生長至90％融合時，分別加入吉西他濱（20 μmol/L），冬凌草甲素（40 μmol/L）和兩藥聯(lián)合作用48 h后，同時設(shè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的DMSO處理48 h為對照，每組3個復(fù)孔。胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min。冷PBS洗2次，按Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明用500 μL Binging Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻，室溫避光作用15 min上機檢測，檢測細胞數(shù)為1×104/組。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，Cellquest軟件分析。

1.5 RT-PCR檢測細胞NF-κB、XIAP基因的表達 收集處于對數(shù)生長期的胰腺癌細胞分別加入分別加入吉西他濱（20 μmol/L），冬凌草甲素（40 μmol/L）和兩藥聯(lián)合作用48 h后收集細胞，同時設(shè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的DMSO處理48 h為對照，加入TRIzol試劑抽提細胞總RNA，按照操作說明應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，GeneAmp9600型PCR儀進行擴增。NF-κB引物：上游5′-AGCACAGATACCACCAAGACCC-3′,下游5′-CCCACGCTGCTCTTCTATAGGAAC-3′,目的產(chǎn)物長度 300 bp；XIAP引物：上游5′-TTCCTCGGGTATATGGTGTCTGAT-3′,下游5′-CCGTGCGGTGCTTTAGTTGT-3′,目的產(chǎn)物長度292 bp；GAPDH引物：上游5′-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′,下游5′-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′,目的產(chǎn)物長度 216 bp。NF-κB 和XIAP反應(yīng)條件均為：預(yù)變性94℃4 min；變性94℃30 s，退火54℃30 s，延伸72℃1 min；最后延伸10 min，共30個循環(huán)；GAPDH反應(yīng)條件均為：預(yù)變性94℃4 min；變性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃1 min；最后延伸10 min，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。XIAP和NF-κB的基因表達水平以目的基因與內(nèi)參GAPDH光密度的比值表示，并進行校正。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，均數(shù)之間比較用方差分析，多重比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對胰腺癌SW1990細胞增殖抑制的作用 不同濃度冬凌草甲素作用SW1990細胞24、48及72 h后，隨給藥濃度的升高，SW1990細胞生長受抑制程度逐漸升高,具有明顯的劑量與時間依賴性。40 μmol/L冬凌草甲素作用48 h后，細胞死亡率接近50％，見圖1。

Fig.1 The effects of oridonin on the proliferation of pancreatic cancer SW1990 cells圖1 冬凌草甲素對胰腺癌SW1990細胞增殖的影響

2.2 冬凌草甲素和吉西他濱對SW1990細胞存活率的影響 與對照組相比，冬凌草甲素或吉西他濱單獨作用細胞48 h后存活率均明顯下降，而聯(lián)合組作用細胞48 h后，細胞的存活率較其余各組下降更明顯（均P＜0.05），見表1。聯(lián)合組作用后聯(lián)合指數(shù)（CI）為0.784。

Tab.1 Comparison of the survival rates and apoptotic rates of pancreatic cancer SW1990 cells between four groups表1 48h后各組胰腺癌SW1990細胞存活率及凋亡率的比較 （n=3,％,±s）

Tab.1 Comparison of the survival rates and apoptotic rates of pancreatic cancer SW1990 cells between four groups表1 48h后各組胰腺癌SW1990細胞存活率及凋亡率的比較 （n=3,％,±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，P＜0.05；表2同

組別對照組(1)吉西他濱組(2)冬凌草甲素組(3)聯(lián)合組（4）F細胞存活率100.00±0.00 43.55±0.48a47.64±0.49a25.14±0.23abc3 911.17＊＊細胞凋亡率9.07±0.15 32.40±0.31a21.00±0.27a56.71±0.53abc4 745.10＊＊

2.3 冬凌草甲素增強吉西他濱對胰腺癌SW1990細胞的凋亡作用 與對照組相比，冬凌草甲素或吉西他濱單獨作用SW1990細胞48 h后凋亡率均明顯增加，而聯(lián)合組處理后細胞的凋亡率較其余各組增加更明顯（均P＜0.05），見圖2、表1。

2.4 冬凌草甲素和吉西他濱對胰腺癌SW1990細胞NF-κB和XIAP基因表達的影響 與對照組相比，吉西他濱組能上調(diào)SW1990細胞中NF-κB和XIAP基因的表達，冬凌草甲素組、聯(lián)合組均能明顯降低細胞中NF-κB和XIAP的表達，聯(lián)合組較其他各組降低更為明顯（均P＜0.05），見圖3、表2。

3 討論

胰腺癌是消化道惡性腫瘤死亡中的主要原因之一，它具有病情進展快和缺乏特定癥狀的特征，其早期診斷很大程度上相當(dāng)困難,而且治療效果差，預(yù)后不良[7]。目前以吉西他濱為基礎(chǔ)的化療是治療胰腺癌最主要的內(nèi)科治療手段，但有效率較低，中位生存期6個月左右，5年生存率仍無明顯提高[8]。因此，尋求安全有效的方法增強胰腺癌細胞對化療藥物的敏感性，以期增加吉西他濱的療效顯得尤為重要。

Fig.3 Results of RT-PCR for XIAP,NF-κB and GAPDH of SW1990 cells in four groups圖3 各組胰腺癌SW1990細胞XIAP、NF-κB和內(nèi)參GAPDH的基因表達PCR圖

Tab.2 Comparison of the expression levels of XIAP and NF-κB between four groups表2 各組細胞XIAP和NF-κB基因表達水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of the expression levels of XIAP and NF-κB between four groups表2 各組細胞XIAP和NF-κB基因表達水平比較（n=3，±s）

組別對照組(1)吉西他濱組(2)冬凌草甲素組(3)聯(lián)合組（4）F XIAP基因1.00±0.00 1.19±0.21a0.82±0.11a0.45±0.05abc987.45＊＊NF-κB基因1.00±0.00 1.20±0.13a0.83±0.07a0.59±0.03abc734.61＊＊

本研究中觀察到冬凌草甲素能顯著抑制胰腺癌SW1990細胞的增殖，這與最近的報道是一致的[5]。另外流式細胞儀檢測冬凌草甲素作用后的胰腺癌細胞，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡率與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示冬凌草甲素對胰腺癌SW1990細胞生長抑制方式可能是以細胞凋亡方式為主。有研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可提高伊馬替尼、三氧化二砷等藥物的促凋亡作用[9-10]。在冬凌草甲素和吉西他濱對胰腺癌SW1990細胞的聯(lián)合用藥研究中，冬凌草甲素一定程度上增強了胰腺癌SW1990細胞對吉西他濱的敏感性，聯(lián)合用藥組顯著抑制胰腺癌細胞增殖，與各單藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且兩藥CI＜1，證實冬凌草甲素能協(xié)同吉西他濱對胰腺癌細胞的增殖抑制作用。Annexin V-FTIC/PI雙染法檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素和吉西他濱聯(lián)合組作用SW1990細胞誘導(dǎo)更多的凋亡細胞，與冬凌草甲素及吉西他濱單藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示冬凌草甲素協(xié)同吉西他濱對胰腺癌細胞生長抑制可能是以誘導(dǎo)細胞凋亡方式為主。

Fig.2 Results of cell apoptosis in SW1990 cells in four groups圖2 各組胰腺癌SW1990細胞流式細胞凋亡圖

NF-κB廣泛存在于哺乳動物細胞中，通過調(diào)控多種基因的表達來調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、調(diào)亡以及癌變，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB在胰腺癌細胞中呈陽性表達，并在胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥性的形成方面起了非常重要作用[12]；而當(dāng)NF-κB的活性被抑制時吉西他濱能增強對胰腺癌的抗腫瘤療效[13]。IAPs家族是目前研究最深入的凋亡調(diào)控基因之一，其中的XIAP以及survivin（IAP蛋白成員）在轉(zhuǎn)錄水平也是受NF-κB調(diào)控的，它們也有助于胰腺癌的耐藥性的形成，這又可通過抑制NF-κB的活性而被抑制[14]。最近的研究發(fā)現(xiàn)中藥大黃素可通過抑制NF-κB及XIAP的活性增強吉西他濱對胰腺癌的敏感性[15]；且冬凌草甲素能下調(diào)胰腺癌中IAPs家族中另一重要成員survivin在胰腺癌中表達從而促進細胞的凋亡，因此推測冬凌草甲素能下調(diào)XIAP在胰腺癌的表達。本研究中，吉西他濱上調(diào)胰腺癌細胞中的NF-κB及XIAP表達，這與以前的文獻報道相符[15]；而冬凌草甲素下調(diào)胰腺癌細胞中的XIAP表達，這驗證了筆者的推測；另外冬凌草甲素也下調(diào)胰腺癌細胞中的NF-κB，并且二者聯(lián)合時胰腺癌細胞中NF-κB及XIAP的表達水平呈明顯下調(diào)，表明冬凌草甲素可能通過降低胰腺癌細胞中NF-κB及其下游XIAP的表達來增強吉西他濱對胰腺癌的抑制作用。

總之，本實驗結(jié)果表明冬凌草甲素可顯著抑制胰腺癌細胞的生長，增強吉西他濱對胰腺癌細胞的促凋亡作用，其可能的機制是通過下調(diào)胰腺癌中NF-κB及其所調(diào)控的凋亡抑制蛋白XIAP的表達，但具體機制尚需要進一步研究。

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（2014-02-08收稿 2014-05-19修回）

（本文編輯 李國琪）

Inhibitory Effects of Oridonin Combined with Gemcitabine on Pancreatic Cancer SW1990 Cells

ZHOU Liming1,2,BU Heqi3,LIU Dianlei2,JIN Haimin2,ZHOU Mengtao1△
1 Department of Hepatopancreatobiliary Surgery,The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000,China;2 Department of Surgery,Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine; 3 Department of Surgery,Tongde Hospital of Zhejiang Province△

E-mail:buheqi@163.com

ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of oridonin combined with gemcitabine on pancreatic cancer SW1990 cells in vitro,and the potential mechanisms thereof.MethodsThe pancreatic cancer SW1990 cells were treated with vehicle alone and various concentrations(10,20,40,80 and160 μmol/L)of oridonin,followed by 24,48 and 72 h cell culture.Effects of oridonin on cell proliferation were determined by using a CCK-8 kit.SW1990 cells were treated with oridonin(40 μmol/L)and gemcitabine(20 μmol/L)alone or together for 48 h,and the untreated cells were used as the control.The cell survival rate was detected by CCK-8 assay.Apoptosis induction was assessed by using Annexin V-FITC kit. Semi-quantitative RT-PCR was used to examine the changes of NF-κB mRNA and XIAP mRNA expressions.ResultsOridonin inhibited the growth of pancreatic cancer SW1990 cells in a dose-and time-dependent manner.Compared with the other groups,the cell survival rate was significantly lower in the combination group(P＜0.05).Oridonin combined with gemcitabine induced a higher percentage of apoptosis in pancreatic cancer cells than that of oridonin or gemcitabine alone (P＜0.05).Moreover,the expressions of NF-κB and XIAP mRNA in pancreatic carcinoma cells were obviously down-regulated in combination group(P＜0.05).ConclusionOridonin can enhance the antitumor effect of gemcitabine on pancreatic cancer in vitro,which may be related to through the down-regulation of NF-κB and its downstream of XIAP,and then inducing cell apoptosis in pancreatic cancer.

pancreatic neoplasms;cell line,tumor;RUBESCENSINE;apoptosis;NF-kappa B;XIAP;gemcitabine

R735.9

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.003

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2013ZQ026）

1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科（郵編325000）；2杭州市中醫(yī)院外科；3浙江省立同德醫(yī)院外科

△通訊作者 E-mail:buheqi@163.com