竺平暉 浙江省舟山市普陀區(qū)人民醫(yī)院藥劑科 舟山 316100

花椒多酚類(lèi)化合物對(duì)腦卒中后抑郁大鼠腦組織NE、5-HT及MAO的影響

竺平暉 浙江省舟山市普陀區(qū)人民醫(yī)院藥劑科 舟山 316100

目的探討花椒多酚類(lèi)化合物總提取物（ZPPC）抗腦卒中后抑郁作用機(jī)制。方法建立腦卒中后抑郁大鼠模型，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)ZPPC、氟西汀對(duì)受試大鼠腦組織去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）含量的影響；采用熒光分光光度法測(cè)定ZPPC和嗎氯貝胺對(duì)受試大鼠腦內(nèi)單胺氧化酶（MAO）活性的影響。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，模型組NE、5-HT水平顯著降低（P＜0.05），ZPPC高劑量組（200mg/kg）和氟西汀組與模型組比較，NE、5-HT水平均有顯著性升高（P＜0.05）；ZPPC中、高劑量組（100mg/kg和200mg/kg）還明顯抑制大鼠腦組織MAO-A活性（P＜0.05）。結(jié)論ZPPC組能顯著提高腦卒中后抑郁大鼠腦組織NE、5-HT水平，其作用機(jī)制可能與抑制腦組織MAO-A活性有關(guān)。

大鼠；腦卒中后抑郁；花椒多酚類(lèi)化合物；NE；5-HT；MAO

腦卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是腦卒中后常見(jiàn)的并發(fā)癥，臨床發(fā)病率為20%～50%。抑郁癥可影響患者原發(fā)疾病的康復(fù)和轉(zhuǎn)歸，并增加腦血管病患者的病死率[1]。PSD的病因非常復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PSD的發(fā)生與神經(jīng)生物學(xué)有關(guān)，即腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的代謝紊亂。目前的研究集中在5-羥色胺能神經(jīng)傳遞通路的改變上，研究發(fā)現(xiàn)，患者外周血去甲腎上腺素（NE）和5-羥色胺（5-HT）含量減少[2]，這可能是PSD發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)。花椒為蕓香科植物青椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.Et Zucc.或花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.的干燥成熟果皮，味辛，性溫，小毒，具有“溫中止痛，驅(qū)蟲(chóng)，外用燥濕，殺蟲(chóng)止癢”的功效[3]，其主要化學(xué)成分有生物堿、酰胺、木脂素、香豆素、揮發(fā)油和脂肪酸等。研究表明[4]，花椒多酚類(lèi)化合物總提取物（ZPPC）急性給藥在小鼠行為絕望模型中顯示出明顯的抗抑郁作用。本研究通過(guò)建立卒中后抑郁動(dòng)物模型，采用酶聯(lián)免疫法觀察ZPPC對(duì)模型大鼠腦組織NE、5-HT水平的影響，熒光分光光度法測(cè)定ZPPC對(duì)受試大鼠腦內(nèi)單胺氧化酶（MAO）活性的影響，從而為臨床預(yù)防腦卒中后抑郁提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng) 物 雄性SD大鼠105只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK（滬）2012-0002，二級(jí)，體質(zhì)量＞250g。每籠5只，室溫（23±1）℃，濕度（50±10）%，自然光照，自由攝食飲水。

1.2藥品與試劑 花椒自備。粉碎，丙酮-水溶液（7：3）浸提，減壓除去浸提液中丙酮，然后過(guò)濾殘留水液，將濾液經(jīng)醋酸乙酯萃取分離，脫水干燥，得到花椒多酚類(lèi)化合物總粗提取物（ZPPC），得率為0.033%。ZPPC為黃棕色粉末，實(shí)驗(yàn)前用雙蒸水配成所需濃度。氟西?。好绹?guó)禮來(lái)公司。二氫溴犬脲胺、4-氫喹啉、司立吉林、氯吉林、嗎氯貝胺均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所?？垢腥舅帲呵嗝顾?。5-HT試劑盒：上海達(dá)豪生物科技有限公司。NE試劑盒：上海富眾生物科技發(fā)展有限公司。甲醛（分析級(jí)）、乙醚（分析純）、冰乙酸：無(wú)錫市晶科化工有限公司。

1.3儀 器 DZKW電熱恒溫水浴鍋：天津市精科材料試驗(yàn)機(jī)廠。FSH-Ⅱ高速電動(dòng)勻漿器：江蘇金壇實(shí)驗(yàn)儀器廠。BIO-RAD550全自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國(guó)伯樂(lè)。BS110S分析天平：北京塞多斯儀器公司。TGL-16GA冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。R-5000熒光分光光度計(jì)：日本島津公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組 105只健康SD大鼠，隨機(jī)分為：①雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎、行為限制+ZPPC高、中、低組（ZPPC組）；②雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎、行為限制+氟西汀組（氟西汀組）；③嗎氯貝胺（嗎氯貝胺組，單胺氧化酶活性測(cè)試）；④單純雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎、行為限制組（模型組）；⑤假手術(shù)組（空白對(duì)照組）。

2.2模型制備 腦卒中模型參照劉匯波等[5]造模法制備。腦卒中后抑郁大鼠模型的制備[6]：將成功達(dá)到腦缺血模型的大鼠，連續(xù)7天，每天10：00～16：00任取時(shí)間限制在特制的觀察籠中，予以2h的行為限制。如大鼠表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)活動(dòng)性明顯降低、興趣缺乏、進(jìn)取性降低、易絕望等特點(diǎn)則為造模成功。

2.3給藥方法 模型制備成功后開(kāi)始給藥，按照正常成人和大鼠每千克體質(zhì)量等效劑量換算系數(shù)，計(jì)算ZPPC高中低組每天給藥劑量相當(dāng)于含花椒多酚類(lèi)化合物總提取物藥量分別為200mg/kg、100mg/kg和50mg/kg，制為藥液1.5mL灌胃，1天1次，給藥3周。氟西汀組給予氟西汀膠囊水溶液灌胃，按2.06mg/（kg·d）給藥，1天1次，給藥3周。嗎氯貝胺組測(cè)試前60min按20mg/kg灌胃給藥；模型組及假手術(shù)組予生理鹽水1.5mL灌胃，1天1次，給藥3周。

2.4NE、5-HT含量測(cè)定 各組于3周后處死大鼠，取出腦海馬區(qū)部分組織，稱(chēng)重后置入1mL玻璃組織勻漿器中，加入預(yù)冷的0.1%高氯酸400mL，冰浴上下轉(zhuǎn)動(dòng)8min，充分研磨使組織勻漿化后，將組織勻漿液倒入離心管內(nèi)，置離心機(jī)內(nèi)以（4℃）10 000×g離心15min，吸取上清液，用0.1%高氯酸溶液定容至0.5mL。大鼠腦組織中NE、5-HT的含量測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.5單胺氧化酶活性測(cè)定[7]分離出部分腦組織，稱(chēng)重后加入4mL冰冷磷酸緩沖液（pH7.8，0.05mol/L）制成勻漿液，在2.5mL磷酸緩沖液中加入20%曲通0.4mL和組織勻漿液0.2mL，溶液混合后38℃預(yù)孵育10min，在反應(yīng)液中加入30μL 2.19mmol/L底物，37℃孵育30min，反應(yīng)液中加入0.2mL高氯酸溶液（5mol/ L）中止反應(yīng)，冷卻并離心10min；取0.5mL上清液，加入1mol/L氫氧化鈉溶液2.5mL。通過(guò)熒光分光光度計(jì)在激發(fā)光318nm、發(fā)射光380nm處測(cè)定產(chǎn)物4-氫喹啉的熒光強(qiáng)度。單胺氧化酶活性以nmol/30min/mg protein表示。采用Bradford法[8]測(cè)定蛋白含量。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件，計(jì)量資料以（） 表示，進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），組間差異采用Dunnrtt’s t-test。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1各組大鼠腦組織NE、5-HT含量比較 與空白對(duì)照組比較，模型組NE、5-HT水平顯著降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，ZPPC低、中、高組NE、5-HT水平上升趨勢(shì)明顯，其中ZPPC高劑量組NE、5-HT與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），此結(jié)果與陽(yáng)性對(duì)照藥組氟西汀組的結(jié)果趨于一致。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腦組織NE、5-HT含量比較（） ng/mL

表1 各組大鼠腦組織NE、5-HT含量比較（） ng/mL

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

3.2各組大鼠腦組織MAO活性比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠MAO-A活性有升高趨勢(shì)，而MAO-B活性有一定的抑制，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，ZPPC低、中、高劑量組大鼠MAO-A活性顯示出梯度抑制，且ZPPC中（100mg/kg）、高（200mg/kg）劑量組MAO-A活性抑制差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ZPPC各劑量組對(duì)MAOB的活性無(wú)明顯影響（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦組織MAO活性比較（）nmol/30min/mg protein

表2 各組大鼠腦組織MAO活性比較（）nmol/30min/mg protein

注：與模型組比較，△P＜0.05；與ZPPC中劑量組比較，*P＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組ZPPC低劑量組ZPPC中劑量組ZPPC高劑量組嗎氯貝胺組劑量/（mg/kg）00 50.00 100.00 200.00 20.00 n/只15 15 15 15 15 15 MAO-A 65.2±3.3 69.3±3.0 60.8±3.6 42.6±3.3△29.5±2.5△* 22.1±1.5△MAO-B 162.5±6.2 159.6±7.3 160.7±8.5 162.6±6.7 158.6±7.7 160.5±8.3

4 討論

目前認(rèn)為PSD的發(fā)病機(jī)制主要有兩種，一種是生物學(xué)機(jī)制，認(rèn)為卒中直接損傷了與情緒有關(guān)的神經(jīng)環(huán)路，影響5-羥色胺能和去甲腎上腺素能神經(jīng)元及其通路，導(dǎo)致兩種遞質(zhì)水平降低而引起抑郁[9]；另一種是社會(huì)心理學(xué)機(jī)制，認(rèn)為卒中后的心理應(yīng)激障礙是PSD的主要原因。研究表明[10-11]，單胺能遞質(zhì)環(huán)路在抑郁的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本研究亦發(fā)現(xiàn)模型組大鼠NE和5-HT含量均低于空白對(duì)照組（P＜0.05），表明卒中后抑郁模型大鼠腦組織NE和5-HT含量水平降低。而ZPPC高劑量組（200mg/kg）和氟西汀組可明顯提高模型大鼠腦組織NE和5-HT含量水平，表明ZPPC對(duì)卒中后抑郁大鼠腦內(nèi)單胺遞質(zhì)降低有改善作用，這可能是其治療PSD的機(jī)制之一。

有研究表明[12]，單胺氧化酶抑制劑可引起單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)末梢的儲(chǔ)存和釋放增加，從而提高單胺能神經(jīng)的活性，改善情緒。單胺氧化酶根據(jù)底物的特異性和對(duì)抑制劑的敏感性分為A、B兩類(lèi)。MAO-A被低濃度的氯吉林抑制，主要氧化NE和5-HT；而MAO-B的特異性底物為苯乙胺，選擇性的酶抑制劑為司來(lái)吉林，主要影響腦內(nèi)多巴胺（DA）的代謝。嗎氯貝胺作為選擇性單胺氧化酶抑制劑的代表藥，可選擇性作用于MAO-A，而對(duì)MAO-B型作用短暫而輕微。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，腦卒中后抑郁大鼠在給予ZPPC低、中、高劑量處理后，MAO-A活性顯示出梯度抑制，且在ZPPC100mg/kg和200mg/kg劑量組MAO-A活性抑制差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這也驗(yàn)證了ZPPC急性給藥結(jié)果[4]。ZPPC在行為絕望模型中呈現(xiàn)出明顯的抗抑郁作用，其作用機(jī)制可能通過(guò)抑制腦內(nèi)單胺氧化酶活性有關(guān)。而ZPPC各劑量組對(duì)MAO-B的活性無(wú)明顯影響（P＞0.05），這可能與ZPPC特異性作用于MAO-A有關(guān)，其確切的抗卒中后抑郁機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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Influence of Polyphenol Extract from Zanthoxylum Bungeanum Maxim.on Norepinephrine,5-hydroxytryptamine and Monoamine Oxidase in Brain Tissue of Rats With Post-Stroke Depression

ZHU Pinghui. Department of Pharmacy,Zhoushan Putuo People's Hospital,Zhoushan(316100),China

ObjectiveTo explore the mechanism of polyphenol extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim.（ZPPC）on treating post-stroke depression.MethodsPost-stroke depression model of rat was established.ELISA was used to detect the influence of ZPPC and fluoxetine on norepinephrine（NE）and 5-hydroxytryptamine（5-HT）contents in brain tissue and the monoamine oxidase（MAO）activity in rats brain was determined by fluorescence spectrophotometry.ResultsThe levels of NE and 5-HT in brain tissue was significantly lower in model group as compared with control group（P＜0.05）,but dramatically elevated after treatment with high-dose ZPPC（200mg/kg）and fluoxetine（P＜0.05）.The activity of MAO in rats brain was inhibited by intervention of ZPPC with 100 and 200 mg/kg as compared with model group（P＜0.05）.ConclusionZPPC can upregulate NE and 5-HT in brain tissue of rats with post-stroke depression and the underlying mechanism may involve inhibition of MAO activity.

rats；post-stroke depression；polyphenols extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim；norepinephrine；5-hydroxytryptamine；monoamine oxidase

2013-10-22