劉芃芃 于文文 程亞楠 韓 雷 陳永孜 魏熙胤 李 慧任秀寶 于津浦

·基礎(chǔ)研究·

基于3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的肺癌類(lèi)干細(xì)胞的分離和鑒定*

劉芃芃①②于文文②程亞楠①韓 雷①陳永孜③魏熙胤④李 慧②任秀寶②于津浦①②

目的：本研究建立三維細(xì)胞培養(yǎng)方法（3D）以分離和鑒定肺癌類(lèi)干細(xì)胞，并與二維細(xì)胞培養(yǎng)方法（2D）比較，初步探討該方法在評(píng)價(jià)肺癌體外增殖、凋亡、侵襲和藥物反應(yīng)性方面的應(yīng)用。方法：將人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞與RPMI 1640和伊格爾基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basal medium of eagle，BME）制成細(xì)胞懸液，培養(yǎng)7 d，收集細(xì)胞采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行類(lèi)干細(xì)胞表型檢測(cè)，以及體外成球、耐藥性、體內(nèi)成瘤等干細(xì)胞功能鑒定，并將3D與2D細(xì)胞培養(yǎng)的A549細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果：細(xì)胞表型檢測(cè)證明3D系統(tǒng)培養(yǎng)的A549細(xì)胞中CD44和CD326陽(yáng)性比例升高，CD24陽(yáng)性比例下降，細(xì)胞體外成球率顯著升高（28.50%±1.17%vs. 8.67%±0.80%，P＜0.01）對(duì)順鉑耐藥性顯著提高。加藥后48 h為58.17%±2.19%vs.33.27%±5.76%（P＜0.01），加藥后72 h為41.70%±5.81%vs.27.30%±4.25%（P＜0.01），體內(nèi)成瘤時(shí)間顯著縮短［（20.75±0.85）d vs.（60.25±1.49）d，P＜0.01］。結(jié)論：3D培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞中獲得更高比例的類(lèi)干細(xì)胞樣細(xì)胞，具有體內(nèi)成瘤快、體外成克隆團(tuán)率高、耐藥性提高的特征。

肺癌 3D細(xì)胞培養(yǎng) 腫瘤干細(xì)胞

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，目前在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率及病死率均位居前列［1］。盡管在分子分型和靶向治療上取得了重大的進(jìn)展，但是肺癌的5年生存率并未得到有效改善，高復(fù)發(fā)仍然是肺癌致死的主要原因［2］。近年來(lái)，腫瘤干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用受到廣泛關(guān)注，研究表明，肺癌干細(xì)胞在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)和耐藥的過(guò)程中起著重要作用［3］。干細(xì)胞具備高增殖能力、高侵襲力、多向分化、化療抵抗和壽命長(zhǎng)等特征，極大程度上影響了肺癌患者的預(yù)后。因此，建立特異性類(lèi)干細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)深入探討類(lèi)干細(xì)胞特征，進(jìn)一步闡明肺癌的發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，尋找更有效的肺癌靶向治療藥物具有重要意義。

文獻(xiàn)報(bào)道，在癌癥研究中3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)法模擬細(xì)胞體內(nèi)生存環(huán)境的缺陷，通過(guò)立體培養(yǎng)為細(xì)胞提供一個(gè)更加接近體內(nèi)生存條件的微環(huán)境［4］。而且3D培養(yǎng)得到的細(xì)胞形態(tài)比2D的更加精確，細(xì)胞形態(tài)精確與否常常對(duì)細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響［5］。為此，在前期研究基礎(chǔ)上建立一套基于3D的肺癌類(lèi)干細(xì)胞培養(yǎng)和分離方法，將人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549接種至RPMI 1640培養(yǎng)基和BME為基礎(chǔ)的3D培養(yǎng)體系中，簡(jiǎn)單易操作。本研究欲利用3D培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，從中分離類(lèi)干細(xì)胞，觀察其是否比2D的細(xì)胞系具有更強(qiáng)的增殖能力，更低的凋亡，更高的轉(zhuǎn)移潛能以及更差的藥物反應(yīng)性［6-8］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 A549肺癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞中心，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%Trypsin胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，BME、回收液購(gòu)自美國(guó)BD公司，二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Antibiotic-Antimycotic購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。細(xì)胞因子購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD326抗體及同亞型對(duì)照IgG2b、PE標(biāo)記的CD24抗體及同亞型對(duì)照IgG1、APC標(biāo)記的CD44抗體及同亞型對(duì)照IgG1等均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，順鉑（cisplatin，DDP）注射液購(gòu)自云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 動(dòng)物 Scid裸鼠，體質(zhì)量17～18 g，SPF級(jí)動(dòng)物，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司繁育，動(dòng)物證號(hào)為SYXK（京）2012-0001。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)科研機(jī)構(gòu)委員會(huì)批準(zhǔn)，符合國(guó)家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)分為3D組和2D組2組。在2D培養(yǎng)組中A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液，以細(xì)胞1×104個(gè)/孔接種于普通96孔板中，0.25%胰酶消化、傳代、到期后回收細(xì)胞。在3D培養(yǎng)組中以200 μL同樣的濃度加到已鋪好BME的96孔板里，到期后用分散酶消化BME、回收液回收細(xì)胞。誘導(dǎo)出的肺癌類(lèi)干細(xì)胞，分別用于體內(nèi)動(dòng)物模型的建立以及類(lèi)干細(xì)胞篩選。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔為平行對(duì)照。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)類(lèi)干細(xì)胞特異性抗體 收集兩組培養(yǎng)3、7、11、14、20 d的細(xì)胞，分別制成細(xì)胞懸液，每管細(xì)胞調(diào)整為1×105個(gè)，分別用抗體標(biāo)記物標(biāo)記，進(jìn)行流式細(xì)胞儀免疫表型檢測(cè)，鑒定類(lèi)干細(xì)胞。

1.2.3 成球?qū)嶒?yàn) 將2組培養(yǎng)7 d的細(xì)胞以5×103個(gè)/孔用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基接種到6孔板中，7 d后觀察細(xì)胞的成球率。

1.2.4 藥物反應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 將3D和2D培養(yǎng)7 d的A549細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，空白對(duì)照孔只加培養(yǎng)液。置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞完全貼壁，次日分別加入100 μL含順鉑的培養(yǎng)基，每孔總體積為200 μL。每組做3個(gè)平行孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h，而后每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心培養(yǎng)板，棄上清，加入DMSO 150 μL/孔，微量震蕩器輕微振蕩10 min，溶解結(jié)晶。在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度（OD值），按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。MTT實(shí)驗(yàn)在不同日重復(fù)3次。

1.2.5 體內(nèi)動(dòng)物模型建立 將2組培養(yǎng)7 d的細(xì)胞分別以細(xì)胞5×104個(gè)/只接種到Scid裸鼠體內(nèi)，每組4只。每3天測(cè)量瘤塊的A（長(zhǎng)）和B（寬），按下列公式計(jì)算瘤塊的體積。瘤塊體積（V）=3.14×A2×B/6，并繪制生長(zhǎng)曲線，X軸代表體內(nèi)接種后的天數(shù)，Y軸代表測(cè)量的瘤塊體積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3D培養(yǎng)細(xì)胞的表型鑒定

2.1.1 3D培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞表面抗體檢測(cè) CD326、CD44陽(yáng)性率升高，CD24陽(yáng)性率降低為干細(xì)胞鑒定指標(biāo)。結(jié)果表明，3D培養(yǎng)7 d的A549細(xì)胞表面CD326與CD44雙陽(yáng)性比例顯著高于2D培養(yǎng)組（15.33%± 0.55%vs.1.50%±0.53%，56.13%±2.98%vs.6.23%± 0.91%，P＜0.01，圖1），但CD24明顯低于2D培養(yǎng)組（1.10%±0.26%vs.67.63%±0.94%，P＜0.01）。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)3D培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)有大量的肺癌類(lèi)干細(xì)胞存在。

2.2 3D培養(yǎng)細(xì)胞的功能檢測(cè)

2.2.1 成球?qū)嶒?yàn) 干細(xì)胞可以形成單克隆微球體，直徑超過(guò)70 μm被認(rèn)為是1個(gè)單克隆微球體。A549細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，3D培養(yǎng)的要比2D培養(yǎng)的細(xì)胞成球率高（28.50%±1.17%vs.8.67%±0.80%，P＜0.05，圖2），這說(shuō)明3D培養(yǎng)出了更高比例的類(lèi)干細(xì)胞樣細(xì)胞。

圖1 比較3D和2D培養(yǎng)的肺癌類(lèi)干細(xì)胞表面抗體陽(yáng)性率Figure 1 Comparison of antibody positive rate in surface of lung cancer stem-like cells between 3D and 2D cultured

圖2 比較3D與2D培養(yǎng)肺癌細(xì)胞7 d后的成球率Figure 2 Comparison of balling rate for lung cancer cells between 3D and 2D cultured for 7 days

2.2.2 藥物反應(yīng)性檢測(cè) 分別提取第7天3D培養(yǎng)和2D培養(yǎng)的A549細(xì)胞接種于96孔板（5×104/mL），同時(shí)加入順鉑，MTT法比較2種培養(yǎng)提取的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。結(jié)果為2組細(xì)胞加入順鉑后，24 h細(xì)胞存活率無(wú)明顯區(qū)別（75.27%±1.99%vs.79.30%±3.48%，P＜0.01），但是在48 h和72 h，3D組細(xì)胞存活率均高于2D組（58.17%±2.19% vs.33.27%±5.76%，41.70%±5.81%vs.27.30%±4.25%，P＜0.05，圖3），表明3D培養(yǎng)的細(xì)胞較2D培養(yǎng)的細(xì)胞更具耐藥性。

圖3 比較3D與2D培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)性Figure 3 Comparison of drug resistance in lung cancer cells between 3D and 2D cultured

2.2.3 體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 將2組培養(yǎng)出來(lái)的A549細(xì)胞以5×104個(gè)/只分別接種至Scid裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。3D組的A549細(xì)胞接種小鼠成瘤至1 cm3的時(shí)間顯著少于2D［（20.75±0.85）d vs.（60.25±1.49）d，P＜0.01）］，腫瘤生長(zhǎng)速度比2D快，接種后第20天腫瘤體積明顯大于2D組［（967.0±2.726）mm3vs.（346.1±2.023）mm3，P＜0.05，圖4］。

圖4 比較3D與2D培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞在Scid裸鼠體內(nèi)的成瘤生長(zhǎng)曲線Figure 4 Comparison of tumor growth curves in vivo between 3D and 2D cultured lung cancer cells

3 討論

腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞具有對(duì)化療藥物的天然耐藥性，并與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等密切相關(guān)。腫瘤干細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞內(nèi)數(shù)量極少但具有極強(qiáng)的繁殖和誘導(dǎo)正常細(xì)胞惡化能力，也是腫瘤獲得耐藥性的主要原因之一［9］。

傳統(tǒng)的2D方法在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞擴(kuò)增、模擬細(xì)胞體內(nèi)生存環(huán)境等方面存在缺陷［10］。首先不能模擬正常組織中的化學(xué)信號(hào)或分子梯度［11］，干擾細(xì)胞表面蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而影響細(xì)胞的主要代謝途徑和基因表達(dá)［12］。到目前為止，在2D中尚未找到有效的方法培養(yǎng)出足夠數(shù)量的腫瘤干細(xì)胞。

相對(duì)于2D，3D容納了更高密度的細(xì)胞黏附和增殖空間，有利于細(xì)胞間信號(hào)傳遞，更能夠模擬細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞形態(tài)比2D的更加接近體內(nèi)生存微環(huán)境下的形態(tài)［13］。3D培養(yǎng)方法使細(xì)胞生長(zhǎng)空間更大，營(yíng)養(yǎng)物和代謝物流通順暢，同時(shí)也無(wú)體內(nèi)眾多干擾因素存在，因此，更有利于腫瘤普通細(xì)胞，尤其是類(lèi)干細(xì)胞自我繁殖形成克隆團(tuán)，導(dǎo)致類(lèi)干細(xì)胞比例明顯增多。

為進(jìn)一步驗(yàn)證3D培養(yǎng)的A549是否可以增殖出更多的肺癌類(lèi)干細(xì)胞，本研究選擇了3種特異性肺癌干細(xì)胞表面抗體CD326、CD44和CD24，采用流式細(xì)胞分離術(shù)以鑒定肺癌類(lèi)干細(xì)胞。CD326被稱(chēng)為人類(lèi)上皮抗原（HEA），是早期干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物之一，多表達(dá)在內(nèi)皮祖細(xì)胞上［14］。CD44屬于黏附分子，可介導(dǎo)多種細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），促進(jìn)T、B細(xì)胞分化以及T細(xì)胞活化，與腫瘤的關(guān)系主要表現(xiàn)在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移兩個(gè)方面［15］。CD24是一種表達(dá)于髓核組織細(xì)胞表面的分子標(biāo)記，能參與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和分化過(guò)程，為陰性標(biāo)志物［16］。結(jié)果表明3D培養(yǎng)的A549細(xì)胞出現(xiàn)了CD326、CD44陽(yáng)性比例升高和CD24比例降低，并且陽(yáng)性率是2D的9.22倍，這說(shuō)明經(jīng)過(guò)3D培養(yǎng)后肺癌類(lèi)干細(xì)胞比例明顯增加。在此基礎(chǔ)上，本研究又進(jìn)行了一系列功能學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)3D培養(yǎng)的A549細(xì)胞要比2D的細(xì)胞體外成球率高，對(duì)順鉑耐藥性顯著提高，體內(nèi)成瘤時(shí)間短，這些都證明經(jīng)3D培養(yǎng)的A549細(xì)胞具有一定的干細(xì)胞功能特征，表明3D培養(yǎng)有大量的肺癌類(lèi)干細(xì)胞存在。

綜上所述，3D培養(yǎng)有利于腫瘤類(lèi)干細(xì)胞的生成，這為腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)和篩選提供了一個(gè)更為有效迅速的方法，為腫瘤干細(xì)胞研究、靶向治療藥物研發(fā)和腫瘤臨床治療提供了有效手段。但本研究?jī)H限于肺腺癌細(xì)胞系，是否適用于肺鱗癌細(xì)胞系、肺癌原代細(xì)胞、肝癌細(xì)胞系或者肝癌原代細(xì)胞，以及是否提高其干細(xì)胞比例還有待于進(jìn)一步研究。

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（2014-03-26收稿）

（2014-06-16修回）

（本文編輯：楊紅欣）

劉芃芃 碩士。專(zhuān)業(yè)方向?yàn)槟[瘤藥理學(xué)，包括利用3D培養(yǎng)分離干細(xì)胞研究。

E-mail：cgtwins@126.com

·讀者·作者·編者·

吸煙與ER陽(yáng)性乳腺癌相關(guān)

根據(jù)一項(xiàng)新的研究結(jié)果，青年女性吸煙者罹患常見(jiàn)類(lèi)型乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)升高。研究者發(fā)現(xiàn)，在20歲至44歲的女性人群中，平均每天吸煙一盒，煙齡超過(guò)10年者，患ER陽(yáng)性乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)比少吸煙或不吸煙者高出60%。（Cancer 2014年2月10日在線版）。研究者們分析了2004-2010年間美國(guó)大西雅圖地區(qū)確診為乳腺癌的年輕女性群體資料。其中778例為ER陽(yáng)性乳腺癌。另納入938名健康婦女作為對(duì)照。結(jié)果表明：曾經(jīng)吸煙的年輕女性罹患乳腺癌的幾率比從不吸煙者高30%。作者認(rèn)為，香煙中可能存在一些物質(zhì)，其作用類(lèi)似雌激素，導(dǎo)致ER陽(yáng)性乳腺癌的發(fā)生。

我國(guó)是世界上最大的煙草生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，每年因吸煙導(dǎo)致死亡的人數(shù)已超過(guò)100萬(wàn)，至2050年將突破300萬(wàn)，二手煙暴露也極為普遍。然而，我國(guó)公眾對(duì)吸煙的嚴(yán)重危害普遍缺乏認(rèn)識(shí)，煙民中年輕人占據(jù)的比例仍在不斷攀升，部分人還抱有錯(cuò)誤觀念，以致控?zé)煹挠X(jué)悟與動(dòng)力不足。因此，以堅(jiān)實(shí)的科學(xué)證據(jù)昭示吸煙危害是推動(dòng)控?zé)煹年P(guān)鍵。

——引自《全球腫瘤快訊》

Isolation and identification of lung cancer stem-like cells based on a 3D cell culture system

Pengpeng LIU1,2,Wenwen YU2,Ya'nan CHENG1,Lei HAN1,Yongzi CHEN3,Xiyin WEI4,Hui LI2,Xiubao REN2,Jinpu YU1,2

Jinpu YU;E-mail:jinpu_yu@hotmail.com
1Cancer Molecular Diagnosis Core,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital National Clinical Research Center for Cancer,Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin,China;2Department of Biotechnology,Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy;3Laboratory of Cancer Cell Biology;4Public Laboratory of Cancer Cell Biology,Tianjin 300060,China
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81272221)

Objective:To highlight the developmental process of 3D cell culture technology system,which is more suitable for isolating and identifying lung cancer stem-like cells than 2D cell culture technology system,and to explore the application of 3D cell cultures in the evaluation of proliferation,apoptosis,invasion,and drug resistance of lung cancer.Methods:Cells(104/well)from the human lung adenocarcinoma cell lines A549 and RPMI 1640 were cultured in complete medium containing 10%fetal bovine serum. Cell suspension was cultured in a BME basal medium.A growth curve was drawn after 7 d of culture.The stem-like cell was identified through a mammosphere culture,drug resistance and invasion assay,and flow cytometry.Data of A549 cells cultured in 3D and 2D traditional cell culture technologies were compared.Results:Cells from the 3D cell culture had higher tumor formation rates[(20.75± 0.85)d vs.(60.25±1.49)d,P＜0.01)]and tumor sphere formation(28.50%±1.17%vs.8.67%±0.80%,P＜0.01)than those from the 2D cell culture.Moreover,cells from 3D cell culture were more invasive and resistant to therapy(58.17%±2.19%vs.41.70%±5.81%in 48 h,P＜0.01;33.27%±5.76%vs.27.30%±4.25%in 72 h,P＜0.01).Phenotype experimental results demonstrated that the CD44 and CD326 cells were double-positive,whereas the CD24 cell was negative.Conclusion:The proportion of stem-like cells in A549 cell line after 3D cell culture significantly increased compared with 2D cell culture.The 3D cell culture can promote the proliferation of lung cancer stem cells.

lung neoplasms,3D cell culture,cancer stem cells

10.3969/j.issn.1000-8179.20140494

①天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤分子診斷中心，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津市300060）；②生物技術(shù)研究室，天津市腫瘤免疫與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；③腫瘤細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；④公共實(shí)驗(yàn)室

?本文課題受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81272221）資助

于津浦 jinpu_yu@hotmail.com