徐惠娟，周守標(biāo)

安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院安徽省重要生物資源保護(hù)與利用研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽蕪湖241000

小鼠T-bet啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建及活性鑒定

徐惠娟，周守標(biāo)

安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院安徽省重要生物資源保護(hù)與利用研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽蕪湖241000

為了研究T-bet在T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，并研究其在多發(fā)性硬化癥中的信號(hào)通路，本研究構(gòu)建小鼠TBX21(編碼T-bet)基因啟動(dòng)子區(qū)和增強(qiáng)子區(qū)螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體。在對(duì)小鼠TBX21基因5?側(cè)翼區(qū)進(jìn)行詳盡生物信息學(xué)特征分析后，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，用PCR的方法從小鼠基因組中擴(kuò)增出TBX21基因5?側(cè)翼區(qū)–1 000 bp?28 bp片段長(zhǎng)為1 028 bp的啟動(dòng)子區(qū)(以翻譯起始點(diǎn)ATG為+1)和–3 308 bp?–2 000 bp片段長(zhǎng)為1 308 bp的非編碼區(qū)保守序列(No-coding conserved sequence,CNS)，再用定向克隆的方法將這兩個(gè)片段定向重組入專門用于啟動(dòng)子活性研究的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體(pGL4.10)中，構(gòu)建出包含小鼠TBX21基因啟動(dòng)子區(qū)和CNS區(qū)的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體(pGL4.10-TBX 21pr-CNS)，電泳與測(cè)序鑒定，最后再將pGL4.10-TBX21pr-CNS與內(nèi)參pRL-TK用lipofectam ine 2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞中，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)鑒定pGL4.10-TBX 21pr-CNS的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性，并用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)照組共轉(zhuǎn)染pGL4.10與內(nèi)參pRL-TK。結(jié)果表明，成功構(gòu)建出熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒pGL4.10-TBX21pr-CNS。與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pRL-TK組相比，293T細(xì)胞(P＝0.012 2)和Jurkat細(xì)胞(P＝0.002 2)中轉(zhuǎn)染pGL4.10-TBX 21pr-CNS組熒光素酶活性升高。研究結(jié)果表明在293T細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞中pGL4.10-TBX21pr-CNS可以表現(xiàn)出啟動(dòng)子活性，為后續(xù)小鼠T-bet轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究提供了基本材料。

T-bet，啟動(dòng)子，熒光素酶，報(bào)告基因，轉(zhuǎn)錄調(diào)控

適應(yīng)性免疫應(yīng)答(Adaptive immunity)反應(yīng)中的T淋巴細(xì)胞按其功能主要分為3個(gè)群：輔助性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。輔助性T細(xì)胞至少包括Th1、Th2、Th17和濾泡輔助T細(xì)胞(Tfh)，這4個(gè)獨(dú)立細(xì)胞亞群都表達(dá)各自的主要轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子。表達(dá)特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet的Th1細(xì)胞，主要通過(guò)分泌IFN-γ，在抗胞內(nèi)病原體(病毒、細(xì)菌)的感染中發(fā)揮重要作用[1-2]；Th2細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-10、IL13，在清除寄生蟲等和過(guò)敏反應(yīng)中意義重大，它的轉(zhuǎn)錄因子為GATA-3[3-4]；Th17細(xì)胞的主要調(diào)控子為RORγt，產(chǎn)生IL-17A、IL-17F和IL-21，在防御某些腸道病原菌的感染方面發(fā)揮積極作用[5]。

Szabo等首先于2000年報(bào)道了輔助T細(xì)胞亞型Th1細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子T-bet(T-box expressed in T cells)[6]。它是T-box基因家族的新型轉(zhuǎn)錄因子，因剛發(fā)現(xiàn)時(shí)被認(rèn)為只表達(dá)于T細(xì)胞內(nèi)而得名。T-bet為T-box基因家族Tbrl亞家族成員[7]，含530個(gè)氨基酸，其中有一個(gè)189個(gè)氨基酸組成的能與T盒DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。人與小鼠的TBX21基因(編碼T-bet)具有88%的同源性。T-bet在naive T細(xì)胞向Th1方向分化時(shí)具有重要的作用。T-bet作為Th1細(xì)胞的譜系限定轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于Th1細(xì)胞的分化及穩(wěn)定起了非常重要的作用。同時(shí)T-bet又能通過(guò)抑制其他細(xì)胞亞型的細(xì)胞因子的表達(dá)從而抑制其分化。Th1細(xì)胞又稱為炎癥性T細(xì)胞，介導(dǎo)與細(xì)胞內(nèi)病毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，參與細(xì)胞免疫及遲發(fā)型超敏性炎癥的形成，目前報(bào)道與多種自身免疫疾病相關(guān)[8]，尤其與人類的自身免疫病多發(fā)性硬化癥有關(guān)。

多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis，MS)是一種由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病，它也是一種累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)的自身免疫疾病[9]。它的自身反映性T細(xì)胞所識(shí)別的靶抗原是神經(jīng)髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein，MBP)等。隨著病情的發(fā)展，最終可導(dǎo)致全身癱瘓和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能喪失。其具體的發(fā)病機(jī)制依然不十分清楚，一般認(rèn)為異常激活的抗原特異性CD4+T淋巴細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并針對(duì)特異性髓鞘蛋白，如髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(M yelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG35-55，)、髓鞘磷脂堿性蛋白(M yelin basic protein,MBP)、髓鞘蛋白脂蛋白(M yelin proteolipid protein，PLP)等產(chǎn)生免疫反應(yīng)，引起炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘，導(dǎo)致了多發(fā)性硬化癥的發(fā)病。實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)在臨床癥狀和發(fā)病機(jī)理上和多發(fā)性硬化癥很相似[10]，因此被認(rèn)為是MS理想的動(dòng)物模型[11]。在此前發(fā)現(xiàn)Th1細(xì)胞是介導(dǎo)多發(fā)性硬化癥發(fā)病的主要細(xì)胞亞型之一，但是當(dāng)IFN-γ敲除之后EAE發(fā)病并沒有很好地緩解反而加重[12]。而T-bet敲除就不能誘導(dǎo)EAE發(fā)病了[13]，這表明T-bet作為Th1介導(dǎo)EAE的關(guān)鍵的細(xì)胞因子[14]，然而其作用機(jī)制還不清楚。

啟動(dòng)子是真核基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游一段長(zhǎng)度不等的特異性序列，能順式調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是指能使與它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增強(qiáng)的DNA序列。目前發(fā)現(xiàn)的保守的非編碼區(qū)序列(No-coding conserved sequence，CNS)類似于一般遠(yuǎn)端的增強(qiáng)子。我們用VISTA tools比對(duì)軟件對(duì)小鼠和人TBX 21基因上游5 kb序列進(jìn)行比對(duì)，得到一個(gè)保守性且轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)較多的CNS。為了研究Th1在介導(dǎo)的多發(fā)性硬化癥中的信號(hào)通路的作用，我們構(gòu)建了含小鼠T-bet啟動(dòng)子和CNS的熒光素酶報(bào)告基因，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性的檢測(cè)鑒定了所構(gòu)建的報(bào)告基因載體的有效性。為下一步研究Th1/Th17細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病多發(fā)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制提供了材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞株和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coli DH5α、人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)、T淋巴細(xì)胞系Jurkat、細(xì)菌人工染色體RP23-451G13由本課題組保存；pGL4.10、pRL-TK購(gòu)置于Promega公司。

1.1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)置于Gibgo公司；PCR反應(yīng)試劑盒、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶購(gòu)置于大連寶生物有限公司；DNA marker購(gòu)置于天根生化科技(北京)有限公司和Fermentas公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)置于博邁德生物有限公司；轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000購(gòu)置于Life technology公司；雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)置于Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 T-bet基因啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析

根據(jù)UCSC中小鼠和人全基因組序列，選取小鼠和人T-bet基因TBX21轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5 kb，在線用VISTA tools進(jìn)行序列分析比對(duì)，得到小鼠TBX21基因上游起始位點(diǎn)5 kb內(nèi)非編碼區(qū)保守序列(No-coding conserved sequence，CNS)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)原則和GenBank中小鼠TBX 21基因序列，應(yīng)用Prime Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物：TBX 21啟動(dòng)子上游引物加入KpnⅠ酶切位點(diǎn)(GGTACC)，下游引物加入XhoⅠ酶切位點(diǎn)(CTCGAG)，并分別在上游和下游引物的5?端加上保護(hù)堿基；TBX21 CNS上游引物加入SfiⅠ酶切位點(diǎn)(GGCCTAACTGGCC)；下游引物加入KpnⅠ酶切位點(diǎn)(GGTACC)。引物由南京金斯瑞有限公司合成，啟動(dòng)子擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 028 bp，CNS擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 308 bp。

1.2.3 小鼠T-bet基因啟動(dòng)子區(qū)和CNS區(qū)序列擴(kuò)增

以細(xì)菌人工染色體(BAC，RP23-451G 13)為模板，用TBX 21 pr U/D和TBX21 CNS U/D兩對(duì)引物，分別擴(kuò)增TBX21啟動(dòng)子和CNS DNA序列。擴(kuò)增體系為：Taq DNA聚合酶0.125 μL、10×緩沖液2.5 μL、dNTP m ix 2 μL、模板DNA 2 μL、引物一1 μL、引物二1 μL、滅菌雙蒸水16.375 μL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：94℃預(yù)變性5 m in，94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min 30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物行于瓊脂糖凝膠中，在100 V電壓下電泳，256 nm紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.4 小鼠T-bet啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建與鑒定

從瓊脂糖凝膠中切出需回收的產(chǎn)物電泳條帶，用膠回收試劑盒對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物TBX21pr進(jìn)行純化，純化后再次進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。確認(rèn)后將PCR純化產(chǎn)物TBX 21pr和pGL4.10載體用KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切。將酶切純化產(chǎn)物TBX21pr與pGL4.10載體連接。連接體系為pGL4.10載體1 μL、SolutionⅠ5 μL、酶切純化產(chǎn)物TBX 21pr 3 μL、滅菌雙蒸水1 μL。體系置于金屬浴中16℃連接2 h。連接的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α后，接種于含Amp+LB培養(yǎng)皿培養(yǎng)篩選。挑取8個(gè)單菌落，接種5 m L Amp+LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，然后小提質(zhì)粒，用KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切，4 h后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以鑒定目的片段是否轉(zhuǎn)入。將經(jīng)過(guò)鑒定的陽(yáng)性克隆菌落搖菌，提質(zhì)粒，送測(cè)序。重組載體命名為pGL4.10-TBX21-pr。再將PCR純化產(chǎn)物TBX 21 CNS3/4/5/6與pGL4.10-TBX 21-pr用SfiⅠ、KpnⅠ雙酶切。將酶切純化產(chǎn)物TBX21 CNS與pGL4.10-TBX 21-pr連接。連接體系為pGL4.10-TBX 21-pr 1 μL、SolutionⅠ5 μL、酶切純化產(chǎn)物TBX21 CNS 3 μL、滅菌雙蒸水1 μL。體系置于金屬浴中16℃連接2 h。連接的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α后，接種于含Amp+LB培養(yǎng)皿培養(yǎng)篩選。挑取8個(gè)單菌落，接種5 m L Amp+LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，然后小提質(zhì)粒，用KpnⅠ、SfiⅠ雙酶切，4 h后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以鑒定目的片段是否轉(zhuǎn)入。將經(jīng)過(guò)鑒定的陽(yáng)性克隆菌落搖菌，提質(zhì)粒，送測(cè)序。測(cè)序由北京華大基因研究中心有限公司完成。重組載體命名為pGL4.10-TBX21-pr-CNS。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 μg/m L青霉素、100 μg/m L鏈霉素的高糖型DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，相對(duì)濕度95%。細(xì)胞用0.1%胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行消化傳代。細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用轉(zhuǎn)染試劑lipofectam ine 2000按照l(shuí)ife technology公司提供的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

T細(xì)胞Jurkat培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100μg/mL青霉素、100 μg/m L鏈霉素的RPM I1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，相對(duì)濕度95%，3?4 d傳代一次。細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用0.4 cm電轉(zhuǎn)杯在電轉(zhuǎn)儀340 V的條件下電轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)染所用的質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.6 熒光素酶活性檢測(cè)

用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System(E1960)進(jìn)行樣品螢光素酶活性檢測(cè)，方法如下：轉(zhuǎn)染前一天接種2.5×105個(gè)細(xì)胞于24孔板上。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后加入PBS清洗細(xì)胞，再加入100 μL的PLB(Passive lysis buffer)，室溫輕微振搖15 m in，收集細(xì)胞裂解液。收集細(xì)胞裂解液，使用手動(dòng)的雙螢光檢測(cè)儀(Promega，GloM ax生物發(fā)光檢測(cè)儀)讀值：將20 μL每樣品加入100 μL LARⅡ工作液，快速混勻，讀值2 s。讀值完畢后，每樣品再加入100 μL Stop&GloRReagent，快速混勻后，放入發(fā)光檢測(cè)儀中，讀值2 s；保存數(shù)據(jù)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5軟件處理分析，組間差異用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠T-bet基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5 kb序列生物信息學(xué)分析

在UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得小鼠和人TBX21基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5 kb基因序列，在線用VISTA tools(http://genome.lbl.gov/vista/index.shtm l)進(jìn)行序列分析比對(duì)，得到小鼠TBX21基因上游起始位點(diǎn)5 kb內(nèi)非編碼區(qū)保守序列(No-coding conserved sequence，CNS)(圖1)其中4段非編碼區(qū)保守序列的保守性很強(qiáng)。

2.2 小鼠T-bet啟動(dòng)子區(qū)及CNS擴(kuò)增結(jié)果

以細(xì)菌人工染色體(RP23-451G13)DNA為模板，克隆出2段序列，分別為TBX21啟動(dòng)子序列1 028 bp(–1 000/+28)、TBX 21 CNS3/4/ 5/6 1 308 bp(–3 308/–2 000)(圖2)。

2.3 pGL4.10-TBX 21p r及pGL4.10-TBX21p r -CNS質(zhì)粒鑒定結(jié)果

T B X 2 1啟動(dòng)子的P C R產(chǎn)物插入pGL 4.10-Basic載體后，構(gòu)建成重組載體pGL4.10-TBX 21-pr，用KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定；TNX 21 CNS3/4/5/6的PCR產(chǎn)物插入重組質(zhì)粒pGL 4.10-TBX 21-p r后，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGL4.10-TBX21-pr-CNS，用SfiⅠ/KpnⅠ雙酶切鑒定。圖3顯示了pGL4.10-TBX 21-pr在相應(yīng)位置切出來(lái)載體條帶與目的DNA片段，釋放出1 028 bp大小的片段。pGL4.10-TBX 21-pr-CNS因?yàn)樵贙pnⅠ酶切位點(diǎn)前后均有一個(gè)SfiⅠ酶切位點(diǎn)，因此酶切之后釋放出1 035 bp和1 308 bp兩個(gè)不同大小的片段(圖4)。測(cè)序結(jié)果證實(shí)包含小鼠TBX21啟動(dòng)子和CNS3/4/5/6序列，序列與GenBank里小鼠啟動(dòng)子序列完全匹配，表明包含TBX21啟動(dòng)子報(bào)告基因載體構(gòu)建成功。

圖1 小鼠和人TBX 21基因序列在線VISTA軟件比對(duì)結(jié)果圖Fig.1 VISTA plot of CNS sites(Pink)in human and mouse TBX21 DNA,presented relative to their positions in the mouse genome(horizontal axis).CNS3-6 is located–3kb,from the transcriptional start site of mouse TBX21.

圖2 TBX 21-p r和TBX 21-CNS3/4/5/6的PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR results of TBX21-pr and TBX21-CNS3/4/5/6. 1:PCR product of TBX 21-pr;2:PCR product of TBX21-CNS3/4/5/6;M:TIANGEN DNA marker IV (MD104).

圖3 重組質(zhì)粒pGL 4.10-TBX21-p r的KpnⅠ/XhoⅠ酶切鑒定圖譜Fig.3 Identification of recombinant plasm id pGL4.10 -TBX21-pr digested by KpnⅠand XhoⅠ.

2.4 pGL4.10-TBX 21-p r和pGL4.10-TBX 21-pr-CNS熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果

pGL4.10-TBX21-pr-CNS和pRL-TK共轉(zhuǎn)染表皮細(xì)胞系293T后，測(cè)定螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，并將兩者的比值，作為衡量TBX21啟動(dòng)子活性的依據(jù)。結(jié)果顯示，與pGL4.10相比，重組載體pGL4.10-TBX21 -pr-CNS轉(zhuǎn)染293T(P=0.012 2)和Jurkat (P=0.002 2)細(xì)胞后，熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)顯著增強(qiáng)，兩者相比，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明構(gòu)建的小鼠TBX21啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因pGL4.10-TBX21-pr-CNS具有啟動(dòng)子活性(圖5)。

目前已知T-bet對(duì)于Th1分化及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)起著至關(guān)重要的作用，是Th1細(xì)胞的主要轉(zhuǎn)錄因子，也是免疫系統(tǒng)一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子。目前發(fā)現(xiàn)T-bet表達(dá)存在正負(fù)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，其正調(diào)控主要通過(guò)以下途徑：1)IFN-γ與受體結(jié)合后，誘導(dǎo)T-bet的表達(dá)，而T-bet又可促進(jìn)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-12Rβ2和IFN-γ[15]；2)IL-12與受體結(jié)合后，先誘導(dǎo)IFN-γ，然后經(jīng)IFN-γ再誘導(dǎo)T-bet的轉(zhuǎn)錄；3)與IL-12同源的IL-23和IL-27，分別與相應(yīng)受體結(jié)合后，也誘導(dǎo)T-bet的表達(dá)，而負(fù)調(diào)控主要是GATA3對(duì)T-bet的直接抑制作用[16]。T-bet與STAT1、STAT4、IFN-γ在Th1細(xì)胞中是一種環(huán)狀反饋表達(dá)關(guān)系。但這些細(xì)胞因子是如何調(diào)控T-bet的表達(dá)目前尚不清楚?；虻谋磉_(dá)調(diào)控可在轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后等多個(gè)水平上，但轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平最為重要?；騿?dòng)子的研究是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的一個(gè)重要內(nèi)容，其中啟動(dòng)子的克隆又是基因啟動(dòng)子功能研究的基礎(chǔ)。

隨著生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，各種生物信息學(xué)軟件對(duì)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率逐步提高。在預(yù)測(cè)出結(jié)果之后，再設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物用PCR方法，就可較為容易地克隆出目的片段。這可以大大減少實(shí)驗(yàn)的盲目性，提高實(shí)驗(yàn)效率，已被越來(lái)越多的研究者所采用。本研究前期已經(jīng)對(duì)小鼠T-bet基因的5?非轉(zhuǎn)錄區(qū)調(diào)控序列進(jìn)行了較為充分的分析，依據(jù)分析結(jié)果設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，成功擴(kuò)增出了一段長(zhǎng)約1 028 bp和一段長(zhǎng)約1 308 bp的片段，經(jīng)過(guò)測(cè)序后證實(shí)所克隆片段GenBank中小鼠T-bet基因的5?非翻譯區(qū)序列一致。

報(bào)告基因載體的構(gòu)建是研究啟動(dòng)子功能的一種常用手段，檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)量，可以直接反映所克隆片段的啟動(dòng)子活性[17]。報(bào)告基因常用于測(cè)定啟動(dòng)子對(duì)基因表達(dá)的影響及其與反式作用因子的相互作用，即將所研究的目的基因調(diào)控序列克隆到含有報(bào)告基因的表達(dá)質(zhì)粒中，然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞系，通過(guò)測(cè)定報(bào)告基因表達(dá)的水平，間接評(píng)價(jià)在調(diào)控序列指導(dǎo)下對(duì)基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用。pGL4.10載體多克隆位點(diǎn)下游含有熒光素酶基因，該基因編碼螢火蟲熒光素酶，在ATP、氧氣、和Mg2+存在條件下氧化D-熒光素，產(chǎn)生的熒光產(chǎn)物可以進(jìn)行定量測(cè)定。將調(diào)控序列插入多克隆區(qū)域，驅(qū)動(dòng)螢火蟲熒光素酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，通過(guò)測(cè)定熒光產(chǎn)物的量即可反映該調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄活性。pRL-TK包含一個(gè)編碼海腎熒光素酶的cDNA，海腎熒光素酶的表達(dá)為螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因正態(tài)化提供內(nèi)對(duì)照值，以降低培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目和健康狀況的差別以及細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解效率的差別。

圖4 重組質(zhì)粒pGL4.10-TBX 21-p r-CNS的SfiⅠ/KpnⅠ酶切鑒定圖譜Fig.4 Identification of recombinant plasm id pGL4.10 -TBX21-pr-CNS digested by SfiⅠand KpnⅠ.

圖5 T-bet啟動(dòng)子及非編碼保守序列在293T(A)和Jurkat細(xì)胞(B)中的轉(zhuǎn)錄活性Fig.5 Transcription activity of T-bet gene promoter and CNS in 293T cells(A)and Jurkat cells(B).

本文采用的是雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(Dual-luciferase reporter assay system)檢測(cè)TBX21-luc的活性。雙熒光報(bào)告系統(tǒng)的原理是：利用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的酶結(jié)構(gòu)及底物要求不同而選擇性地區(qū)別這兩種發(fā)光報(bào)告基因的活性。螢火蟲熒光素酶是一個(gè)61 kDa單亞基蛋白，海腎熒光素酶是一個(gè)36 kDa大小的單亞基蛋白。利用兩者底物要求的不同，先加入螢火蟲熒光素酶的底物檢測(cè)其活性(實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因)，然后加入終止液，同時(shí)加入海腎熒光素酶的底物檢測(cè)海腎熒光素酶活性(對(duì)照?qǐng)?bào)告基因)，最后計(jì)算兩者的比值，從而排除轉(zhuǎn)染效率和加樣量的差異，真實(shí)可靠地反映TBX 21-luc的轉(zhuǎn)錄活性。

一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄需要一定大小片段的啟動(dòng)子序列和一系列的增強(qiáng)子序列。非編碼區(qū)保守序列(No-coding conserved sequence，CNS)是最新發(fā)現(xiàn)的類似于增強(qiáng)子的序列。一些轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到CNS區(qū)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。很多文章有報(bào)道通過(guò)構(gòu)建含基因啟動(dòng)子和CNS的熒光素酶報(bào)告基因[18-19]，驗(yàn)證了免疫系統(tǒng)中各輔助T細(xì)胞的分化和增殖的機(jī)制[20]。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了小鼠T-bet啟動(dòng)子和保守非編碼區(qū)熒光素酶報(bào)告基因，并在細(xì)胞內(nèi)鑒定了其具有啟動(dòng)和增強(qiáng)熒光素酶基因表達(dá)的活性，為進(jìn)一步研究T-bet表達(dá)調(diào)控機(jī)制及EAE中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等提供基本材料。

REFERENCES

[1]Koch MA,Perdue NR,Killebrew JR,et al.The transcription factor T-bet controls regulatory T cell homeostasis and function during type 1 inflammation.Nat Immunol,2009,10(6):595–602.

[2]Zheng Y,Chaudhry A,Kas A,et al.Regulatory T-cell suppressor program co-opts transcription factor IRF4 to control TH2 responses.Nature, 2009,458(7236):351–356.

[3]Chaudhry A,Rudra D,Treuting P,et al.CD4+ regulatory T cells control TH17 responses in a Stat3-dependent manner.Science,2009, 326(5955):986–991.

[4]Chung Y,Tanaka S,Chu F,et al.Follicular regulatory T cells expressing Foxp3 and Bcl-6 suppress germ inal center reactions.Nat M ed,2011, 17(8):983–988.

[5]Linterman MA,Pierson W,Lee SK et al.Foxp3+ follicular regulatory T cells control the germ inal center response.Nat Med,2011,17(8):975–982.

[6]Szabo SJ,Kim ST,Costa GL et al.A novel transcription factor,T-bet,directs Th1 lineage comm itment.Cell,2000,100(6):655–669.

[7]Zhang WX,Yang SY.Cloning and characterization of a new member of the T-box gene fam ily.Genom ics,2000,70(1):41–48.

[8]Lazarevic V,Glim cher LH.T-bet in disease.Nat Immunol,2011,12(7):597–606.

[9]Hemmer B,Nessler S,Zhou D et al. Immunopathogenesis and immunotherapy of multiple sclerosis.Nat Clin Pract Neurol,2006, 2(4):201–211.

[10]Stromnes IM,Goverman JM.Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.Nat Protoc,2006,1(4):1810–1819.

[11]Stromnes IM,Goverman JM.Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis.Nat Protoc,2006,1(4):1952–1960.

[12]Lee E,Chanamara S,Pleasure D,et al. IFN-gamma signaling in the central nervous system controls the course of experimental autoimmune encephalomyelitis independently of the localization and composition of inflammatory foci.J Neuroinflammation,2012,9:7.

[13]Bettelli E,Sullivan B,Szabo SJ,et al.Loss of T-bet,but not STAT1,prevents the development of experimental autoimmune encephalomyelitis.J Exp Med,2004,200(1):79–87.

[14]Lovett-Racke AE,Rocchini AE,Choy J,et al. Silencing T-bet defines a critical role in the differentiation of autoreactive T lymphocytes. Immunity,2004,21(5):719–731.

[15]A fkarian M,Sedy JR,Yang J,et al.T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4+T cells.Nat Immunol,2002,3(6): 549–557.

[16]M ullen AC,High FA,Hutchins AS et al.Role of T-bet in comm itment of TH1 cells before IL-12-dependent selection.Science,2001, 292(5523):1907–1910.

[17]A lam J,Cook JL.Reporter genes:application to the study of mammalian gene transcription.Anal Biochem,1990,188(2):245–254.

[18]Djuretic IM,Levanon D,Negreanu V,et al. Transcription factors T-bet and Runx3 cooperate to activate Ifng and silence Il4 in T helper type 1 cells.Nat Immunol,2006,8(2):145–153.

[19]Lew is MD,M iller SA,M iazgow icz MM,et al. T-bet's ability to regulate individual target genes requires the conserved T-box domain to recruit histone methyltransferase activity and a separate fam ily member-specific transactivation domain. M ol Cell Biol,2007,27(24):8510–8521.

[20]Zhang F,Meng G,Strober W.Interactions among the transcription factors Runx1,RORgammat and Foxp3 regulate the differentiation of interleukin 17-producing T cells.Nat Immunol,2008,9(11): 1297–1306.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Construction and identification of luciferase reporter gene containing mouse T-bet promoter

Huijuan Xu,and Shoubiao Zhou
Anhui Provincial Key Laboratory of the Conservation and Exploitation of Biological Resources,College of Life Sciences,Anhui Normal University,Wuhu 241000,Anhui,China

The aim of this study is to clone the mouse T-bet promoter and enhancer,construct and identify the firefly luciferase reporter gene plasm id pGL4.10-TBX 21pr-CNS for T-bet transcription regulation study and its function in signaling of multiple sclerosis.The promoter and CNS of T-bet were predicted by bioinformatics assay.The predicted fragment of mouse T-bet promoter plus CNS was amplified by PCR and cloned into pGL4.10.The recombinant plasm id pGL4.10-TBX 21pr-CNS was transferred into Escherichia coli DH5α.The positive clone was identified by double digestion w ith KpnⅠand SfiⅠand DNA sequencing.Finally,pGL4.10-TBX 21pr-CNS was cotransfected w ith pRL-TK into 293T cells and Jurkat cells,pRL-TK and pGL4.10 as a control.The luciferase activity in 293T cells(P=0.012 2)and Jurkat cells (P=0.002 2)was higher than that of the control group.A fragment of 1 028 bp mouse T-bet promoter plus 1 308 bp CNS was successfully cloned and the firefly luciferase reporter gene plasm id pGL4.10-TBX21pr-CNS was constructed.In 293T cells and Jurkat cells,pGL4.10-TBX21pr-CNS has the promoter functions.This work offers a basic material for the research of T-bet transcription.

T-bet,promoter,luciferase,reporter genes,transcription regulation

February 21,2014;Accep ted:March 18,2014

Shoubiao Zhou.Tel:+86-553-5910810;E-mail:zhoushoubiao@vip.163.com

徐惠娟,周守標(biāo).小鼠T-bet啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建及活性鑒定.生物工程學(xué)報(bào),2014,30(11): 1733–1741.

Xu HJ,Zhou SB.Construction and identification of luciferase reporter gene containing mouse T-bet promoter.Chin J Biotech, 2014,30(11):1733–1741.

Suppo rted by:Natural Science Foundation of Anhui Province(No.11040606M 77),Key Foundation of Education Department of Anhui Province(No.KJ2011A129).

安徽省自然科學(xué)基金(No.11040606M 77)，安徽省高校自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.KJ2011A 129)資助。

時(shí)間：2014-07-31網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140093.htm l