柳亞楠，李夏瑩，李忠華，王永強(qiáng)，李曉齊，曹紅，鄭世軍

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193

傳染性法氏囊病病毒VP4蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

柳亞楠，李夏瑩，李忠華，王永強(qiáng)，李曉齊，曹紅，鄭世軍

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193

傳染性法氏囊病病毒(IBDV)蛋白VP4在抑制宿主免疫應(yīng)答中起重要作用，為制備IBDV VP4的單克隆抗體，以實(shí)驗(yàn)室保存的融合蛋白His-VP4免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合、篩選、亞克隆后獲得4株能穩(wěn)定分泌抗VP4的單抗雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3B3、3H11、4C8和4G6，經(jīng)間接ELISA測(cè)定4株單抗的親和力解離常數(shù)分別為4.61×10–11、1.71×10–10、4.26×10–11和5.02×10–11，均為高親和力抗體。4株單抗的重鏈類(lèi)型分別為IgG1、IgG1、IgG2b和IgG1。進(jìn)一步以Western blotting鑒定，該4株單抗均能特異地識(shí)別IBDV的VP4蛋白，間接免疫熒光和Western blotting試驗(yàn)表明4株單抗均能識(shí)別IBDV感染DF-1細(xì)胞后產(chǎn)生的VP4蛋白。該單抗為檢測(cè)IBDV以及研究IBDV VP4的生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。

傳染性法氏囊病病毒，VP4蛋白，原核表達(dá)，單克隆抗體

傳染性法氏囊病(IBD)，最早報(bào)道于1962年[1]，又稱為“甘保羅病”，是一種危害雛雞的急性高度傳染性的病毒病，在全球范圍內(nèi)廣泛發(fā)生[2]。1979年，我國(guó)于北京上海等地發(fā)現(xiàn)此病，并于上世紀(jì)90年代流行超強(qiáng)毒株[3]。其病原體為傳染性法氏囊病病毒(IBDV)，能夠損傷靶細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞前體)，從而引起患病雞嚴(yán)重的免疫抑制，進(jìn)而增加對(duì)其他病原的易感性[4]。

IBDV屬于雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬，具有單層衣殼，為正20面體結(jié)構(gòu)[5]，直徑為55–65 nm[6]，電鏡下病毒粒子呈晶格狀分布于細(xì)胞漿中[7]。病毒基因組由2個(gè)片段(A和B)的雙股RNA組成，無(wú)囊膜[8]。B片段編碼VP1，是一種RNA依賴的RNA聚合酶[9-10]；A片段由2個(gè)部分重疊的開(kāi)放閱讀框組成[11]。第1個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白VP5，第2個(gè)編碼110 kDa的pVP2-VP4-VP3前體，后被VP4蛋白水解為病毒蛋白VP2、VP3和VP4[12-15]。VP2和VP3是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，分別占病毒粒子的51%和40%[16]。

VP4是病毒的蛋白酶，能夠水解多聚蛋白pVP2-VP4-VP3前體為pVP2、VP4和VP3。VP4還可以促進(jìn)病毒蛋白的成熟，在病毒組裝過(guò)程中不斷修飾VP2蛋白的C端，使其成為成熟的衣殼蛋白[17]。VP4還可發(fā)生自組裝，形成直徑為25 nm的管狀結(jié)構(gòu)[18]，大腸桿菌表達(dá)的VP4蛋白也可發(fā)生自組裝發(fā)揮同樣的生物學(xué)功能[19]。同時(shí)，VP4蛋白能夠激活VP1蛋白合成[20]。最新研究表明VP4蛋白可以抑制Ⅰ型干擾素的表達(dá)和NF-κB的活化，在IBDV引起的免疫抑制中發(fā)揮著重要作用[21]，其652位的絲氨酸和692位的賴氨酸是其發(fā)揮蛋白酶活性和引起免疫抑制的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)[22]。本研究成功表達(dá)VP4重組蛋白并制備出針對(duì)它的單克隆抗體，為進(jìn)一步研究VP4蛋白致病的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、病毒、細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

傳染性法氏囊病病毒(IBDV)Lx毒株由北京市農(nóng)林科學(xué)院劉爵研究員惠贈(zèng)。SP2/0細(xì)胞、DF-1細(xì)胞、DH5α、BL21、質(zhì)粒pGEX-6P-1；IBDV His-VP4、CAV His-VP2、ALV His-GP85、REV His-GP90蛋白、IBDV陽(yáng)性血清均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)免疫生物學(xué)研究室保存。標(biāo)準(zhǔn)雞SPF血清(IBDV陰性血清)購(gòu)自于格林思寶公司。6–8周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.2 儀器及主要試劑

HAT、HT、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents均購(gòu)自Sigma公司。胎牛血清購(gòu)自HyClone公司。DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。PEG 4000購(gòu)自Merck公司。HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，HRP標(biāo)記馬抗山羊IgG，F(xiàn)ITC標(biāo)記兔抗小鼠IgG購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司。LA Taq酶和DNA快速連接試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。dNTPs購(gòu)自CNS公司。膠回收試劑盒購(gòu)自ZYMO RESEARCH公司。高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊公司。離心機(jī)購(gòu)自Sigma公司。96孔板酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN公司。

1.3 vp4基因克隆與重組表達(dá)載體pGEX-6P-1-vp4的構(gòu)建根據(jù)IBDV Lx株vp4基因序列和載體pGEX-6P-1多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物

(P1：5′-GGAATTC ATGGCCGACAAGGGG TACGAGGTAG-3′，P2：5′-CCGCTCGAGCTAA GCCATGGCAAGGTGGTACT-3′)，其中下劃線部分分別為Eco RⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。根據(jù)上述特異性引物擴(kuò)增vp4基因，PCR產(chǎn)物和載體經(jīng)雙酶切回收后進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定選擇陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序，選擇測(cè)序未突變且讀碼框正確的重組原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-vp4。

1.4 融合蛋白GST-VP4的表達(dá)、可溶性分析及純化

將重組載體pGEX-6P-1-vp4和空載體pGEX-6P-1分別轉(zhuǎn)入到BL21表達(dá)菌中，挑取單菌落加入到5 m L含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取其中1 m L菌液接入50 m L含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6–0.8，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)5 h，離心收集菌體。菌體經(jīng)超聲裂解后12 000 r/m in離心20 m in，收取上清。上清進(jìn)行親和層析純化，得到重組蛋白GST-VP4。

1.5 小鼠免疫

以本實(shí)驗(yàn)室保存的His-VP4蛋白作為抗原，免疫8周齡雌性BALB/c小鼠。首次免疫，抗原與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，頸背部皮下多點(diǎn)注射，50μg/只。首免3周后進(jìn)行二免，抗原與等體積弗氏不完全佐劑混合乳化，免疫劑量與途徑同首次免疫。之后，每隔2周按照二免方法免疫，免疫2次。在四免完成后1周，斷尾采血以GST-VP4包被酶標(biāo)板用間接ELISA方法對(duì)免疫小鼠血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。效價(jià)達(dá)到要求后，在融合前3 d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，抗原直接注射小鼠腹腔，50μg/只。

1.6 抗VP4單克隆抗體的制備

按照Current Protocol in Immunology[23]上的方法進(jìn)行細(xì)胞融合，將SP2/0細(xì)胞與無(wú)菌免疫脾細(xì)胞按照1∶10進(jìn)行混合，在盛有37℃水的燒杯中，以預(yù)熱的50%(M/V)PEG 4 000為融合劑逐滴加入細(xì)胞泥中，緩慢加入DMEM后離心，用含20%胎牛血清的DMEM進(jìn)行重懸至每毫升1.2×106個(gè)細(xì)胞，以200μL/孔加入到96孔板中，置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。融合后2、3、4、5、7、9、11 d用含HAT的20%DMEM進(jìn)行半換液，第14天用含HT的20%DMEM進(jìn)行半換液，第15天后換成20%DMEM。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)至孔底的10%–25%時(shí)，在換液2 d后取100μL上清液以GST-VP4包被酶標(biāo)板用間接ELISA方法進(jìn)行篩選，選取2次篩選陽(yáng)性值高的孔用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，亞克隆3次直至所有單克隆細(xì)胞孔陽(yáng)性率為100%。

1.7 腹水制備及純化

給經(jīng)產(chǎn)的BALB/c小鼠腹腔注射滅菌液體石蠟0.5 m L/只，1周后腹腔注射生長(zhǎng)狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞2×106個(gè)/只，待小鼠腹腔膨大后，采集腹水離心后保存于–80℃。

采集的腹水按照硫酸銨沉淀法[24]進(jìn)行純化，透析后分裝保存于–80℃。

1.8 抗VP4單抗的特性鑒定

1.8.1 單抗亞類(lèi)鑒定

采用SIGMA公司的Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents試劑盒進(jìn)行測(cè)定，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.8.2 單抗親和力測(cè)定

應(yīng)用間接ELISA方法測(cè)定單抗親和力。用1μg/m L GST-VP4包被酶標(biāo)板，封閉后向其中加入倍比稀釋的單抗，初始濃度為1μg/m L，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行測(cè)定。ELISA結(jié)果中以連續(xù)讀數(shù)不再增加時(shí)定為抗原100%結(jié)合，以O(shè)D450吸光度值為縱坐標(biāo)，抗體濃度為橫坐標(biāo)做散點(diǎn)圖，生成對(duì)數(shù)趨勢(shì)線及公式。以吸光度最大值一半(視為抗原與抗體結(jié)合率50%)代入公式，求出抗體濃度，即抗體親和力解離常數(shù)(Kd)。

1.8.3 單抗特異性鑒定

用表達(dá)IBDV VP4、ALV GP85、REV GP90、CAV VP2蛋白的大腸桿菌全菌進(jìn)行SDS-PAGE，以制備的單抗為一抗，進(jìn)行Western blotting鑒定。

1.8.4 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定單抗

將DF-1細(xì)胞接種于24孔板，1×105cells/孔，待細(xì)胞密度達(dá)到50%–70%時(shí)，將IBDV接種于細(xì)胞中，并設(shè)置相應(yīng)的陰性對(duì)照。待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，停止培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定和0.2%Triton X-100透化，用1%BSA封閉后加入制備的單抗作為一抗，以FITC標(biāo)記的IgG為二抗，于熒光顯微鏡下判定結(jié)果。

1.8.5 W estern b lotting鑒定單抗

按1.8.4方法進(jìn)行病毒接種，收取相應(yīng)細(xì)胞裂解物，以制備的單抗為一抗進(jìn)行Western blotting鑒定。

2 結(jié)果

2.1 vp4基因克隆與重組表達(dá)載體pGEX-6P-1-vp4的構(gòu)建

如圖1A中顯示，通過(guò)PCR方法，獲得大小為732 bp的目的片段，質(zhì)粒pGEX-6P-1-vp4經(jīng)Eco RⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，出現(xiàn)大小與PCR結(jié)果一致的條帶(圖1B)?；驕y(cè)序結(jié)果正確。

2.2 融合蛋白GST-VP4的純化

對(duì)含質(zhì)粒pGEX-6P-1-vp4的重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在54 kDa處誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白，超聲裂解后在上清和沉淀中均含有目的蛋白。取誘導(dǎo)表達(dá)上清進(jìn)行純化，在54 kDa處純化出GST-VP4(圖2A)，測(cè)定蛋白濃度為0.4 mg/m L。

2.3 抗VP4單抗的制備及特異性鑒定

小鼠4次免疫后，經(jīng)ELISA測(cè)定血清中抗體的效價(jià)均高于1∶10 000。經(jīng)過(guò)融合后得到14個(gè)陽(yáng)性克隆，選取其中6個(gè)進(jìn)行3次亞克隆，得到4株能穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3B3、3H11、4C8和4G6。將雜交瘤細(xì)胞注射到經(jīng)產(chǎn)母鼠體內(nèi)制備腹水，并進(jìn)行純化，測(cè)定并稀釋蛋白濃度至2 mg/m L。

圖1 vp4基因克隆與重組表達(dá)載體pGEX-6P-1-vp4的構(gòu)建Fig.1 Cloning of vp4 gene and construction of its recombinant expression vector pGEX-6P-1-vp4.(A)Cloning of vp4 gene.(B)Digestion of pGEX-6P-1-vp4 plasm id w ith restriction enzyme Eco RⅠand XhoⅠ.

圖2 GST-VP4蛋白的純化與單抗特異性鑒定Fig.2 Purification of recombinant protein VP4 and identification of specificity of anti-VP4 M cAbs.(A) Purification of recombinant protein GST-VP4.(B)Analysis of the specificity of anti-VP4 M cAbs.

用Western blotting方法檢測(cè)原核表達(dá)傳染性法氏囊病病毒(IBDV)His-VP4(33 kDa)、雞傳染性貧血病毒(CAV)His-VP2(34 kDa)、禽白血病病毒(ALV)His-GP85(34 kDa)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)His-GP90(36 kDa)。結(jié)果表明4株單抗均能識(shí)別原核表達(dá)的VP4蛋白，而不識(shí)別對(duì)照組的其他病毒蛋白(圖2B)，因此制備的單抗識(shí)別VP4具有良好的特異性。

2.4 抗VP4單抗亞類(lèi)鑒定

按小鼠單抗亞類(lèi)鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū)(Sigma)鑒定單抗的重鏈類(lèi)型，結(jié)果3B3、3H11和4G6株的重鏈類(lèi)型為IgG1，4C8株的重鏈類(lèi)型為IgG2b。

2.5 抗VP4單抗親和力測(cè)定

應(yīng)用間接ELISA測(cè)定4株單抗的親和力，結(jié)果如圖3顯示，4株單抗的親和力解離常數(shù)(Kd)分別：3B3株：4.61×10–11，3H11株：5.02×10–11，4C8株：1.71×10–10，4G6株：4.26×10–11，表明4株單抗均為高親和力抗體。

2.6 單抗識(shí)別IBDV感染DF-1細(xì)胞產(chǎn)生的VP4蛋白

間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果如圖4A所示，表明4株單抗均能識(shí)別IBDV感染DF-1細(xì)胞后產(chǎn)生的VP4蛋白。同樣，用Western blotting方法檢測(cè)，如圖4B所示：4株單抗均能很好地識(shí)別VP4，而不識(shí)別未感染的陰性對(duì)照。該結(jié)果表明獲得的M cAbs均能識(shí)別天然IBDV病毒蛋白VP4的抗原表位。

圖3 抗VP4單克隆抗體親和力測(cè)定Fig.3 A ffinity test of anti-VP4 M cAbs.(A–D)A ffinity test of 3B3,3H11,4C8 and 4G6.

圖4 單抗識(shí)別病毒感染產(chǎn)生的VP4蛋白Fig.4 Anti-VP4 M cAbs recognize VP4 in IBDV-infected cells.(A)Detection of IBDV VP4 by IFA using indicated M cAbs.(B)Detection of IBDV VP4 by Western blotting using indicated M cAbs.

3 討論

傳染性法氏囊病是由IBDV感染后引起的一種危害雛雞的急性、烈性和高度接觸傳染性疾病。發(fā)病雞存活后出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫抑制，從而導(dǎo)致混合感染和繼發(fā)感染，使死淘率增加，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前認(rèn)為IBDV基因組編碼5種病毒蛋白。VP4蛋白是由多聚蛋白VP2-4-3自剪切產(chǎn)生的一種病毒蛋白酶[25]。

近來(lái)又有研究表明：在致病性IBDV感染雞體內(nèi)存在VP4特異性抗體，但是在弱毒IBDV免疫的雞體內(nèi)幾乎不存在抗VP4蛋白抗體。這個(gè)結(jié)果提示我們，IBDV VP4蛋白特異性抗體可以作為一種區(qū)分致病性與非致病性IBDV的標(biāo)志物，為IBDV的流行病學(xué)研究提供一種新方法。因此，對(duì)雞群VP4抗體水平檢測(cè)具有流行病學(xué)意義，可以用來(lái)區(qū)分疫苗免疫和野毒感染，還可以分析不同病毒的毒力[26]。

在本研究中，利用實(shí)驗(yàn)室保存的His-VP4蛋白免疫BALB/c小鼠，常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合,用本研究表達(dá)純化的GST-VP4作為ELISA包被抗原進(jìn)行篩選，獲得4株能分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。這些單抗不僅識(shí)別用原核表達(dá)的VP4蛋白，也識(shí)別IBDV感染細(xì)胞中的VP4蛋白，說(shuō)明4株單抗均具有識(shí)別天然病毒蛋白VP4的能力。許多研究者利用可以分泌IL-6的飼養(yǎng)層細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，但可能會(huì)有污染細(xì)胞的情況發(fā)生，本研究中利用無(wú)菌過(guò)濾的胸腺培養(yǎng)上清液來(lái)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，能達(dá)到同樣的效果并能避免污染。我們選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行大量擴(kuò)繁凍存保種。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明以重組VP4蛋白制備特異性單克隆抗體效果良好，為深入研究IBDV致病機(jī)理提供了重要的工具，也為建立本病的新型診斷方法提供了生物材料。

中國(guó)是世界上最早發(fā)明陶器的國(guó)家之一，并且是最早發(fā)明瓷器的國(guó)家。英文“china”就有中國(guó)和瓷器的雙重含義，因此西方稱中國(guó)為“瓷”之國(guó)，可見(jiàn)我國(guó)陶瓷藝術(shù)在世界上所具有的深遠(yuǎn)影響。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Preparation and identification of monoclonal antibodies against Infectious Bursal Disease Virus(IBDV)VP4

Ya’nan Liu,Xiaying Li,Zhonghua Li,Yongqiang Wang,Xiaoqi Li,Hong Cao, and Shijun J.Zheng
State Key Laboratory of Agrobiotechnology,College of Veterinary Medicine,China Agricultural University,Beijing 100193,China

Infectious bursal disease virus(IBDV)VP4 plays an important role in immunosuppression of host.In order todevelop monoclonal antibodies(M cAbs)against VP4,we vaccinated BALB/c m ice w ith His-VP4,screened and subcloned positive clones.We established 4 hybridoma cell lines that stably secreted M cAbs against VP4 and named these cell lines 3B3,3H11,4C8 and 4G6,respectively.We tested the dissociation constant(Kd)of these M cAbs,and found that their Kds were 4.61×10–11,1.71×10–10,4.26×10–11,5.02×10–11,respectively.The isotypes of these M cAbs were determ ined to be IgG1,IgG1,IgG2b and IgG1.These McAbs specifically bound to VP4 in IBDV infected DF-1 cells as demonstrated by Western blotting analysis and fluorescence antibody assay.These M cAbs would help to detect IBDV infection and to analyze the biological activities of IBDV VP4.

Infectious Bursal Disease Virus,VP4,prokaryotic expression,monoclonal antibody

February 24,2014;Accep ted:May 12,2014

Shijun J.Zheng.Tel/Fax:+86-10-62734861;E-mail:sjzheng@cau.edu.cn

柳亞楠,李夏瑩,李忠華,等.傳染性法氏囊病病毒VP4蛋白單克隆抗體的制備及鑒定.生物工程學(xué)報(bào),2014,30(11): 1660?1668.

Liu YN,Li XY,Li ZH,et al.Preparation and identification of monoclonal antibodies against Infectious Bursal Disease Virus (IBDV)VP4.Chin J Biotech,2014,30(11):1660?1668.

Suppo rted by:National Natural Science Foundation of China(No.31272543),Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System(No.NYCYTX-41).

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31272543)，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(No.NYCYTX-41)資助。

時(shí)間：2014-05-21網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140106.htm l