郭萍，武瑤，李嘉,3，方榮祥，賈燕濤

1中國(guó)科學(xué)院微生物研究所植物基因組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101 2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049 3北京城市學(xué)院，北京100083

利用水稻原生質(zhì)體快速分析m iRNA靶標(biāo)RNA

郭萍1,2，武瑤1，李嘉1,3，方榮祥1，賈燕濤1

1中國(guó)科學(xué)院微生物研究所植物基因組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101 2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049 3北京城市學(xué)院，北京100083

與轉(zhuǎn)基因方法相比，基因瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在基因表達(dá)研究上具有快速便捷的特點(diǎn)。為檢驗(yàn)水稻m iRNA與靶標(biāo)基因之間的調(diào)控關(guān)系，將MIRNA基因與GFP/靶標(biāo)序列融合基因(或GFP/靶標(biāo)突變序列融合基因)構(gòu)建在同一瞬時(shí)表達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，通過觀察含有GFP/靶標(biāo)序列融合基因和GFP/靶標(biāo)突變序列融合基因的載體之間的熒光強(qiáng)度差異，以及通過qRT-PCR方法檢測(cè)靶標(biāo)和非靶標(biāo)mRNA水平差異來驗(yàn)證m iRNA對(duì)靶標(biāo)基因的調(diào)控。用osaM IR156和osaMIR397及其靶標(biāo)序列對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，熒光顯微觀察和qRT-PCR檢測(cè)證明，osam iR156和osam iR397能降低相應(yīng)靶標(biāo)序列GFP融合基因的轉(zhuǎn)錄物水平和GFP熒光水平。此種水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)方法用于在體內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模m iRNA靶標(biāo)基因檢測(cè)。由于其他近緣單子葉植物很可能與水稻有近似的小RNA加工系統(tǒng)，因此對(duì)于其他單子葉植物m iRNA功能研究也將有很好的應(yīng)用前景。

m iRNA靶標(biāo)，水稻原生質(zhì)體，體內(nèi)熒光檢測(cè)

越來越多的證據(jù)表明，非編碼小RNA (Non-coding small RNA)廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中，作為一類新層次上的基因表達(dá)調(diào)控物質(zhì)對(duì)生物的生長(zhǎng)發(fā)育等多種生理過程具有重要作用。植物內(nèi)源非編碼小RNA主要分為m iRNAs(M icroRNAs)和siRNA(Short interfering RNAs)，siRNA又分為反義轉(zhuǎn)錄物siRNA(Natural antisense transcript siRNA, nat-siRNA)、反式作用siRNA(Trans-acting short interfering RNAs,tasiRNAs)、異染色質(zhì)siRNA (Heterochromatic siRNAs)和長(zhǎng)siRNA(Long siRNA,lsiRNA)等。它們可以通過對(duì)靶標(biāo)mRNA的剪切或翻譯抑制，以及對(duì)DNA或染色體的甲基化等方式調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)[1]。非編碼小RNA像可變電阻一樣，能夠精細(xì)調(diào)控眾多基因的表達(dá)水平，對(duì)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育和功能至關(guān)重要?；蛐酒治霭l(fā)現(xiàn)，在高等真核生物中受m iRNAs調(diào)控的基因就多達(dá)50%[2]。

M icroRNAs是一種約21?23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70?90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工而成。在秀麗線蟲中m iRNA lin-4和let-7被首次發(fā)現(xiàn)，隨后在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒定出數(shù)百個(gè)m iRNAs[3-4]。成熟的miRNAs進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)，并作用于靶標(biāo)RNA的特定靶位點(diǎn)，這些靶位點(diǎn)通常位于mRNA的3′-UTR區(qū)(Untranslated region)或CDS區(qū)(Coding regions)，引起靶標(biāo)RNA的剪切或者翻譯抑制[5]。一個(gè)m iRNA與靶標(biāo)基因只需要部分序列匹配就能完成兩者之間的識(shí)別，這種m iRNA與靶標(biāo)基因的匹配程度的可變性，使得一個(gè)m iRNA可能與多個(gè)靶標(biāo)互作，而一個(gè)靶標(biāo)也可能與多個(gè)m iRNA互作。植物中保守的m iRNA，其在不同物種之間的靶標(biāo)基因也常存在保守性；但不同物種中也存在特異的、非保守的m iRNA靶標(biāo)序列[5]。目前，挖掘m iRNA新靶標(biāo)的方法主要是通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)獲得。由于m iRNA與靶標(biāo)序列為不完全匹配，這對(duì)m iRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性構(gòu)成很大挑戰(zhàn)；而基因克隆、基因芯片和深度測(cè)序等方法對(duì)發(fā)現(xiàn)低豐度和不同時(shí)空表達(dá)的靶標(biāo)基因有一定困難。如果利用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法，兩者取長(zhǎng)補(bǔ)短，將大大加速研究進(jìn)程。

當(dāng)m iRNA進(jìn)入RISC復(fù)合物，復(fù)合物核心成分AGO蛋白(A rgonaute proteins)行使對(duì)靶標(biāo)RNA的切割功能。AGO蛋白在距離m iRNA 5′端第10?11位核苷酸相應(yīng)位置對(duì)靶RNA鏈進(jìn)行精確切割，產(chǎn)生5′磷酸和3′羥基的切割產(chǎn)物，這一特性被用于檢測(cè)mRNA是否為m iRNA的靶標(biāo)[6]。常用的檢驗(yàn)m iRNA靶基因的方法有農(nóng)桿菌注射法和5′RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法。農(nóng)桿菌注射法是將含有m iRNA及靶基因載體的農(nóng)桿菌注射接種植物葉片，檢測(cè)m iRNA對(duì)靶基因的剪切效果[6]；5′RACE法是直接分析miRNA剪切的產(chǎn)物，把接頭連接到m iRNA剪切產(chǎn)物的5′末端，經(jīng)RT-PCR和測(cè)序，精確鑒定m iRNA的切割位點(diǎn)[6]，也是目前m iRNA靶基因鑒定中最廣泛采用的方法。農(nóng)桿菌注射法鑒定m iRNA靶基因與通過轉(zhuǎn)基因植物鑒定方法相比，因其具有簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)而在雙子葉植物中得到廣泛應(yīng)用。水稻等單子葉植物以農(nóng)桿菌注射法成功鑒定m iRNA靶基因尚未見到相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)中將花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的內(nèi)源m iRNA序列，與35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的3′末端融合m iRNA靶標(biāo)序列(或m iRNA靶標(biāo)變異序列)的GFP基因串聯(lián)到pBI221載體，以PEG(聚乙二醇)法轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，通過GFP熒光強(qiáng)度比較發(fā)現(xiàn)，含有m iRNA靶標(biāo)序列載體與含m iRNA靶標(biāo)變異序列載體存在差異，說明m iRNA能夠有效識(shí)別并干擾RNA靶標(biāo)基因的表達(dá)，Real-time PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該結(jié)果。該方法是一種快速有效驗(yàn)證m iRNA的靶標(biāo)的方法，對(duì)于研究水稻m iRNA的功能具有實(shí)用意義。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基及植物材料培養(yǎng)

大腸桿菌DH5α、BL21(DH3)菌株為本實(shí)驗(yàn)室收藏。用于基因瞬時(shí)表達(dá)的pBI221-eGFP、pCAMBIA 1300質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室收藏。常規(guī)LB培養(yǎng)基配制參見文獻(xiàn)[7]。水稻日本晴(Oryza sativa L.var.Nipponbare)種子浸水萌發(fā)后播種于土中(蛭石∶泥炭土=1∶1)，光照培養(yǎng)(光/暗周期為16 h/8 h)。

1.2 主要試劑和儀器

各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、T載體和質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司；無縫克隆試劑盒購自GenBank Biosciences公司；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司；poly(A)聚合酶和FirstChoice?RLM-RACE試劑盒購自Ambion公司；纖維素酶R-10和離析酶R-10購自日本Yakult公司；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自TOYOBO公司。Ambion PCR引物由Invitrogen公司合成。實(shí)時(shí)定量qPCR使用BioRad C1000熒光定量PCR儀，熒光觀察所用儀器為徠卡公司激光共聚焦顯微鏡(型號(hào)Leica SP8)。

表1 本文所用的引物Tab le 1 Prim ers used in this work

1 5 6 -F G G G A A T G A T G T A G C A C G G 1 5 6 -R T C A G G A A T T A C G A A G G G T G B I 1 5 6 -F G A A C A C G G G G G A C T C A C G G G A A T G A T G T A G C A C G G B I 1 5 6 -R G A A A T T C G A G C T G C A C T C A G G A A T T A C G A A G G G T G M G F P -F G A A C A C G G G G G A C T C T A G A G s p l -R -2 G G G A A A T T C G A G C T C A T G A C A G A A G A G A G A G A G C A C A G C T C G A G T A A G A T C T T C C G G A C T T G T A C A s p l m -R -2 G G G G A A A T T C G A G C T C A G G A G A G C A G G G A C A G G G C G C A G C T C G A G T A A G A T C T T C C G G A C T T G T A C A 3 9 7 -F T C C A G A G C G C A C A C T A T T 3 9 7 -R T G A G T T G C T G C A T T G T T G T B I 3 9 7 -F G A A C A C G G G G G A C T C A C T C C A G A G C G C A C A C T A T T B I 3 9 7 -R G A A A T T C G A G C T G C A C T G A G T T G C T G C A T T G T T G T l a c -R G G G G A A A T T C G A G C T C T A G T T G A G T G C A G C G T T G A T G A G C C T C A G C A T G T A A G A T C T T C C G G A C T T G T A C l a c m -R G G G G A A A T T C G A G C T C T A G T T T A A A G C T G C A T T T A T C A G T C T C A G C A T G T A A G A T C T T C C G G A C T T G T A C P o l y ( T ) a d a p t e r G C G A G C A C A G A A T T A A T A C G A C T C A C T A T A G G ( T ) 1 2 V N R P G C G A G C A C A G A A T T A A T A C G A C g f p q r t A C G A G C T G T A C A A G T C C G G m i R 1 5 6 -F T G A C A G A A G A G A G T G A G C A C m i R 3 9 7 -F T C A T T G A G T G C A G C G T T G A T G a c t i n -F T G T A T G C C A G T G G T C G T A C C A a c t i n -R C C A G C A A G G T C G A G A C G A A

1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建

對(duì)pBI221-eGFP質(zhì)粒進(jìn)行改造，將35S啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)的m iRNA基因和3′端融合相應(yīng)m iRNA靶標(biāo)序列的GFP基因構(gòu)建到同一載體上。首先用Ter-F和PML-R，35S-R和PML-F為引物，以pCAMBIA1300-221質(zhì)粒(pBI221經(jīng)Hin dⅢ和Eco RⅠ酶切的小片段插入pCAMBIA1300的Hin dⅢ/Eco RⅠ位點(diǎn))為模板，擴(kuò)增Nos-T終止子和35S啟動(dòng)子片段，將兩個(gè)PCR片段和經(jīng)Eco RⅠ/Hin dⅢ酶切的pCAMBIA1300載體大片段進(jìn)行無縫連接，得到質(zhì)粒pCAMBIA-PML，使pCAMBIA1300-221質(zhì)粒中刪除GUS基因，同時(shí)添加Pm lⅠ酶切位點(diǎn)。用BLG159F/R引物，以質(zhì)粒pCAMBIA-PML為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使35S啟動(dòng)子5′端和終止子3′端加上AatⅡ和NdeⅠ的酶切位點(diǎn)，并克隆到T載體，得到質(zhì)粒T-PML。T-PML經(jīng)AatⅡ和NdeⅠ酶切片段插入pBI221-eGFP載體AatⅡ/NdeⅠ酶切位點(diǎn)，得到本實(shí)驗(yàn)用的載體pBI221-PML。

從miRBase數(shù)據(jù)庫中檢索到水稻osaMIR156的序列信息(http://www.m irbase.org)，用156F/R引物從水稻基因組中擴(kuò)增osaM IR156的全長(zhǎng)基因，以此PCR產(chǎn)物為模板，用BI156F/R引物再次擴(kuò)增，使PCR片段加入15 bp的pBI221-PML載體序列，回收PCR產(chǎn)物與pBI221-PML的Pm lⅠ酶切大片段無縫連接，得到pBI156載體。

以pBI221-eGFP質(zhì)粒為模板，用引物MGFP-F和含有osam iR156靶標(biāo)序列的引物spl-R-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，去除GFP的ORF終止密碼子，并使其3′端融合靶標(biāo)序列得到GFPspl，回收GFPspl片段并與pBI156的Bam HⅠ/SacⅠ酶切產(chǎn)物進(jìn)行無縫連接，得到pBI156spl載體。同樣的，用引物MGFP-F和splm-R-2擴(kuò)增得到GFP和突變靶標(biāo)基因序列融合序列，即GFPsplm，將其與pBI156的Bam HⅠ/SacⅠ酶切產(chǎn)物進(jìn)行無縫連接，得到pBI156splm載體。

與上述構(gòu)建方法相似，用397F/R引物擴(kuò)增出osaMIR397基因的全長(zhǎng)序列，再用BI397F/R引物使擴(kuò)增片段延長(zhǎng)后與pBI221-PML的Pm lⅠ酶切產(chǎn)物無縫連接，得到pBI397載體。

以pBI221-eGFP質(zhì)粒為模板，用MGFP-F和lac-R引物擴(kuò)增，將osam iR397靶標(biāo)序列與GFP融合，得到GFPlac片段，MGFP-F和lacm-R引物擴(kuò)增，將osam iR397靶標(biāo)突變序列與GFP融合，得到GFPlacm片段；回收這兩個(gè)片段，分別與pBI397載體的Bam HⅠ/SacⅠ酶切產(chǎn)物進(jìn)行無縫連接，得到載體pBI397lac和pBI397lacm。

1.4 原生質(zhì)體的制備

采取酶解的方法制備原生質(zhì)體[8]。取生長(zhǎng)約18 d的日本晴水稻小苗的莖部，用刀片切成0.5 mm細(xì)圓片；將圓片移入10 m L酶解液中，酶解液主要成分為1.5%纖維素酶R-10，0.75%離析酶R-10，0.4 mmol/L D-甘露醇，20 mmol/L KCl，20 mmol/L MES[2-(N-嗎啉)乙烷磺酸，pH 5.7]，10 mmol/L CaCl2，5 mmol/L β-巰基乙醇，0.1%BSA；過濾除菌，加入羧芐青霉素至終濃度50 μg/m L，28℃，50 r/min避光振蕩消化4 h；過濾網(wǎng)(200目)過濾酶解液，以50 m L的離心管收集液體，150 r/m in， 5 m in離心沉淀原生質(zhì)體(設(shè)置最低的加速度)；移除上清液，加入W 5緩沖液[154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl,2 mmol/L MES，pH 5.7)]，輕輕顛倒試管洗滌沉淀，150 r/min離心5 m in沉淀原生質(zhì)體，棄上清液。

1.5 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

將制備的原生質(zhì)體用MMg溶液(4 mmol/L MES，0.6 mol/L甘露醇，15 mmol/L MgCl2)重懸至原生質(zhì)體的終濃度約為106個(gè)/m L。100 μL原生質(zhì)體中加入質(zhì)粒載體約20 μg，混勻后加入110 μL 40%PEG溶液(0.6 mol/L甘露醇，100 mmol/L CaCl2,40%V/V PEG4000)溶液，混勻后于28℃孵育15 m in；加入2 m L W 5緩沖液，顛倒混勻；150 r/m in離心3 m in，離心沉淀原生質(zhì)體，棄上清；用500 μL W 5緩沖液重懸原生質(zhì)體，28℃避光靜置過夜。

1.6 GFP熒光顯微觀察

原生質(zhì)體經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化10–12 h，利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度。將500 μL原生質(zhì)體最小加速度150 r/m in離心3 m in，吸取并棄掉450 μL上清，重懸原生質(zhì)體，每次吸取10 μL原生質(zhì)體懸液進(jìn)行顯微觀察，用10×物鏡(數(shù)值孔徑NA為0.4)觀察，多線氬離子激光器激發(fā)，激光能量20%，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為500?600 nm；光電倍增管檢測(cè)器檢測(cè)熒光信號(hào)，增益值800；圖像掃描密度1 024×1 024，掃描速度200 Hz。利用LAS AF Lite軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野熒光通道的平均灰度值[(灰度值總和?背景灰度值)/計(jì)入測(cè)量的像素?cái)?shù)]，作為表征視野內(nèi)發(fā)光細(xì)胞熒光強(qiáng)度的一個(gè)參數(shù)，將其除以原生質(zhì)體細(xì)胞總數(shù)，得到原生質(zhì)體細(xì)胞的平均相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.7 RNA的提取和實(shí)時(shí)定量PCR分析

原生質(zhì)體經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后8–10 h，150 r/m in離心3 min，吸取并棄掉450 μL上清，加入500 μL TRIzol，混勻室溫靜置5 m in，加入100 μL三氯甲烷，混勻室溫靜置5 m in，4℃，12 000 r/m in離心15 min；吸取300 μL上清加入250 μL異丙醇和1 μL糖原，?20℃沉淀過夜；4℃，12 000 r/min離心45 m in沉淀RNA，70%的酒精清洗沉淀，離心5 m in，棄上清，室溫晾干5 m in，用適量無RNase水溶解沉淀。

RNA的加尾和逆轉(zhuǎn)錄操作參考Shi等的工作并稍做改動(dòng)[9]。取1 μg的總RNA經(jīng)DNaseⅠ消化后，在逆轉(zhuǎn)錄酶的工作緩沖液中加入poly(A)聚合酶和ATP，37℃反應(yīng)1 h，使RNA 3′端加上poly(A)尾巴；65℃5 m in，待反應(yīng)產(chǎn)物降至室溫，加逆轉(zhuǎn)錄酶(SuperScript?ⅡReverse Transcriptase)和0.5 μg poly(T)adapter (3′RACE adapter in FirstChoice?RLM-RACE kit)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

以上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行qPCR定量，osamiR156的PCR擴(kuò)增引物為m iR156-F和RP，PCR產(chǎn)物大小64 bp；osam iR397擴(kuò)增引物為miR397-F和RP，PCR產(chǎn)物大小65 bp；GFP基因擴(kuò)增引物為gfpqrt和RP。使用TOYOBO SYBR Green(Realtime PCR Master m ix)試劑盒：20 μL體系中加0.5 μL cDNA模板，1 mmol/L正向引物，1 mmol/L反向引物。反應(yīng)條件：95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建

為在水稻原生質(zhì)體中檢測(cè)miRNA是否能夠剪切其靶標(biāo)基因，我們采取了將m iRNA基因和靶標(biāo)基因串聯(lián)表達(dá)在同一個(gè)植物表達(dá)載體中的策略，兩者均由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。為了便于觀察m iRNA對(duì)靶標(biāo)基因的作用效果，我們將與miRNA互補(bǔ)配對(duì)的含有靶標(biāo)基因序列與去除終止密碼子的GFP基因3′端融合，如果m iRNA能夠剪切靶標(biāo)mRNA，則與靶標(biāo)重組的GFP(稱為GFPc基因)也能被剪切。同時(shí)突變靶標(biāo)基因序列，在不改變其氨基酸序列的前提下使之不與miRNA互補(bǔ)配對(duì)，再與GFP基因序列融合重組成不可被剪切的GFPnc基因，作為GFPc基因的對(duì)照。將GFPc基因和GFPnc基因分別同相應(yīng)的miRNA共同在水稻原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)，通過比較GFPc基因和GFPnc基因的表達(dá)水平，判斷特定miRNA和其候選靶標(biāo)基因的調(diào)控關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)挑選水稻osam iR156和osamiR397及其相應(yīng)的靶標(biāo)基因作為驗(yàn)證對(duì)象，以檢驗(yàn)在水稻原生質(zhì)體中檢測(cè)m iRNA靶標(biāo)基因的方法是否可行。以往的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)水稻osam iR156可以靶向剪切OsSPL14基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從而影響水稻的株型[10]；osamiR397的靶標(biāo)則是水稻的類漆酶基因OsLAC，該基因影響水稻種子大小和花序分支，對(duì)水稻產(chǎn)量有重要影響[11]。如圖1所示，osaMIR156與其相應(yīng)的GFPc和GFPnc基因分別共表達(dá)的載體是pBI156spl和pBI156splm，而osaMIR397對(duì)應(yīng)的載體則是pBI397lac和pBI397lacm。

2.2 顯微觀察蛋白水平差異

將pBI156spl和pBI156splm轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，靜置培養(yǎng)12 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP熒光強(qiáng)度。如圖2(A，D)所示，在相同的轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)條件下，pBI156spl、pBI156splm、pBI397lac和pBI397lacm四種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體都能被激發(fā)綠色熒光，說明增加的后綴序列并未改變GFP蛋白的熒光特性。每種轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的觀察樣品隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行拍照，統(tǒng)計(jì)總的細(xì)胞數(shù)目、發(fā)光的細(xì)胞數(shù)目以及細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度。如圖2B所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，pBI156splm載體轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體平均發(fā)光率(發(fā)光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))達(dá)到39%，是pBI156spl載體轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體平均發(fā)光率(14%)的2.8倍。pBI156splm載體轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的平均相對(duì)熒光強(qiáng)度達(dá)6.25×10?3，多于pBI156spl載體轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的平均相對(duì)熒光強(qiáng)度1.73×10?3，二者存在明顯差異(P<0.01，圖2C)。同樣，pBI397lacm載體轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的平均發(fā)光率和平均發(fā)光強(qiáng)度分別是31%和5.06×10?3，都明顯大于pBI397lac載體轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的平均發(fā)光率和平均發(fā)光強(qiáng)度(分別是18%和2.41×10?3)(P<0.01，圖2E，2F)。說明通過水稻原生質(zhì)體GFP熒光觀察可以判斷m iRNA和其候選靶標(biāo)基因的調(diào)控關(guān)系。

圖1 瞬時(shí)共表達(dá)m iRNA和融合靶標(biāo)序列的GFP基因載體構(gòu)建圖譜Fig.1 Schematic diagram of constructs for coexpression of m iRNA and GFP gene fused w ith target sequences.

圖2 原生質(zhì)體中GFP顯微熒光觀察及定量統(tǒng)計(jì)Fig.2 M icroscopic observation and quantitative statistics of protoplast GFP fluorescence.A and D:GFP excitation of rice protoplasts transducted by pBI156spl,pBI156splm,pBI397lac and pBI397lacm.Bottom panels are enlarged sections of square shown in top panel.B and D:fluorescent ratio of rice protoplasts transducted by pBI156spl,pBI156splm,pBI397lac and pBI397lacm.C and F:relative intensity of fluorescence of rice protoplasts transducted by pBI156spl,pBI156splm, pBI397lac and pBI397lacm.Each column represents an average of ten replicates,and bars indicate SDs.

2.3 qRT-PCR檢測(cè)RNA水平差異

為進(jìn)一步驗(yàn)證通過GFP熒光觀察方法的可靠性，我們通過qPCR方法對(duì)m iRNA和融合靶標(biāo)序列的GFP表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。提取上述進(jìn)行熒光觀察的原生質(zhì)體的總RNA，對(duì)RNA尾部加A后，用poly(T)adapter進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用miRNA特異引物序列和poly(T)adapter特異反向引物進(jìn)行qPCR反應(yīng)，檢測(cè)樣品中miRNA的水平；用GFP基因特異引物gfpqrt和RP引物檢測(cè)樣品中GFP基因mRNA的水平。

檢測(cè)結(jié)果表明，在水稻原生質(zhì)體中osam iR156和osam iR397能夠有效表達(dá)。以水稻actin基因作為內(nèi)參，pBI156spl和pBI156splm質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中osam iR156的水平明顯高于空載體pBI221-PML對(duì)照(圖3A)；pBI397lac和pBI397lacm質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中osam iR397的水平也高于pBI221-PML對(duì)照(圖3B)。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體中m iRNA和GFP基因的表達(dá)水平Fig.3 Quantification of miRNA and GFP transcripts in rice protoplasts by qRT-PCR.(A)Relative expression level of osamiRNA156 in protoplasts transfected w ith pBI156spl,pBI156splm,and control plasmid.(B)Relative expression level of osamiRNA397 in protoplasts transfected w ith pBI156spl,pBI156splm,and control plasm id.(C)Relative expression level of GFP in protoplasts w ith pBI156spl or pBI156splm,respectively.(D)Relative expression level of GFP in protoplasts w ith pBI397lac or pBI397lacm,respectively.Each column represents three replicates,and bars indicate SDs.

以osam iR156表達(dá)水平為內(nèi)參，pBI156spl轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體中的GFP表達(dá)水平降至pBI156splm轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的58%(P<0.05，圖3C)；同樣，以osam iR397的水平為內(nèi)參，pBI397spl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中的GFP表達(dá)水平降至pBI397lacm質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的71%(P<0.05，圖3D)。結(jié)果表明，后綴可被剪切靶標(biāo)序列的GFP基因轉(zhuǎn)錄物水平明顯低于后綴不可被剪切的GFP基因轉(zhuǎn)錄物，說明m iRNA靶標(biāo)序列確實(shí)受m iRNA調(diào)節(jié)影響其表達(dá)水平。

3 討論

M icroRNAs是一類調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小RNA，在動(dòng)植物等真核生物及某些DNA病毒中均有發(fā)現(xiàn)[12]，在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)對(duì)外界生物和非生物脅迫等反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[13-17]。據(jù)m iRBase數(shù)據(jù)庫顯示，水稻基因組中已預(yù)測(cè)有592種m iRNA，其中大部分還未知其靶標(biāo)基因。由于m iRNA和靶標(biāo)RNA的互補(bǔ)程度具有可變性，決定了m iRNA與靶標(biāo)作用是冗余的[18-19]。另外，microRNA及靶標(biāo)基因表達(dá)有時(shí)空特異性，使得直接克隆m iRNA和驗(yàn)證其靶標(biāo)基因的工作變得十分繁瑣而具有挑戰(zhàn)性。通過計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)miRNA的靶標(biāo)基因，對(duì)研究這些m iRNA的調(diào)控功能至關(guān)重要。目前，驗(yàn)證m iRNA和靶標(biāo)基因相互關(guān)系的實(shí)驗(yàn)方法很多，其中通過5′RACE檢測(cè)RNA中有無目標(biāo)基因在靶向序列處的剪切產(chǎn)物是較常用的方法[20]。這種方法快速直接，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍需要其他方法的輔助驗(yàn)證。另外，也可以采取在m iRNA靶標(biāo)基因缺失的植物體內(nèi)，通過轉(zhuǎn)基因過表達(dá)靶標(biāo)基因和靶標(biāo)序列突變的目的基因，比較二者的表達(dá)水平差異的方法[10]；或者通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株使m iRNA的表達(dá)水平不同，并檢測(cè)靶標(biāo)基因的表達(dá)差異的方法[11]。這種植物體內(nèi)的遺傳驗(yàn)證方法的優(yōu)點(diǎn)是比較穩(wěn)定，但是操作周期長(zhǎng)。也有利用農(nóng)桿菌注射瞬時(shí)表達(dá)的方法，在煙草體內(nèi)檢測(cè)m iRNA對(duì)靶標(biāo)基因的調(diào)控作用[20]，但是在雙子葉植物體系中并不適宜檢測(cè)單子葉植物水稻的m iRNA及其靶標(biāo)基因，因?yàn)殡p子葉和單子葉植物中與剪切靶標(biāo)基因的蛋白并不完全相同，如AGO蛋白，在水稻中有19個(gè)，擬南芥中有10個(gè)，m iRNA與AGO的結(jié)合有一定偏好性[21]。

在真核生物中，小RNA對(duì)靶標(biāo)基因的調(diào)控分為轉(zhuǎn)錄后的RNA干擾以及轉(zhuǎn)錄水平上的染色體修飾[22]。本方法是一種適宜檢測(cè)m icroRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的簡(jiǎn)易方法，可以在水稻體內(nèi)快速驗(yàn)證m iRNA和其靶標(biāo)基因的調(diào)控關(guān)系。我們用水稻幼苗制備原生質(zhì)體，載體轉(zhuǎn)化效率約為40%，為后續(xù)基因檢測(cè)提供便利。通過將miRNA及GFP/靶標(biāo)序列融合基因串聯(lián)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，既可以通過GFP熒光強(qiáng)度推斷m iRNA對(duì)靶標(biāo)序列的作用效果，又可以通過qPCR對(duì)含有靶標(biāo)序列的融合基因mRNA水平進(jìn)行定量，如果含有目標(biāo)序列和突變目標(biāo)序列的GFP融合基因的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則判斷m iRNA與靶標(biāo)序列存在調(diào)控關(guān)系。此方法可以快速簡(jiǎn)便地在水稻體內(nèi)驗(yàn)證m iRNA及其候選目標(biāo)mRNA的關(guān)系，與轉(zhuǎn)基因方法相比具有很大優(yōu)勢(shì)。另外，在其他單子葉植物中，如玉米，與水稻中編碼DCL、AGO和RDR基因數(shù)目相近，進(jìn)化樹分析也顯示這些基因的親緣關(guān)系[23]，因此，也可以利用水稻原生質(zhì)體研究與水稻親緣關(guān)系較近的物種中新的m iRNA及其靶標(biāo)的調(diào)控關(guān)系。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Efficient transient expression to analyze m iRNA targets in rice protop lasts

Ping Guo1,2,Yao W u1,Jia Li1,3,Rongxiang Fang1,and Yantao Jia1

1 State Key Laboratory of Plant Genomics,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China 2 University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China 3 Beijing City University,Beijing 100083,China

Compared w ith the transgenic approach,transient assays provide a convenient alternative to analyze gene expression.To analyze the relationship between m iRNAs and their target genes,a rice protoplast system to detect target gene activity was established.The M IRNA and GFP-fused target sequence(or GFP-fused mutated sequence as a non-target control)were constructed into the same plasm id,and then delivered into rice protoplasts.The GFP expression level decreased significantly when the protoplasts were transfected w ith the plasm id containing GFP-fused target compared to that of the plasm id w ith non-target sequence either by fluorescence m icroscopy or qRT-PCR method.Two m icroRNA genes,osaMIR156 and osaMIR397,and their target sequences were used to prove the feasibility of the rice protoplast transient assay system.This method w ill facilitate large-scale screening of rice m iRNA target in vivo,and may be suitable for functional analysis of m iRNAs of other monocot plants that m ight share the evolutionarily conserved small RNA processing system w ith rice.

m iRNA target,rice protoplast,in vivo fluorescence assay

February 17,2014;Accep ted:April 8,2014

Yantao Jia.Tel:+86-10-64861838;Fax:+86-10-64858245;E-mail:jiayt@im.ac.cn

郭萍,武瑤,李嘉,等.利用水稻原生質(zhì)體快速分析m iRNA靶標(biāo)RNA.生物工程學(xué)報(bào),2014,30(11):1751?1762.

Guo P,Wu Y,Li J,et al.Efficient transient expression to analyze m iRNA targets in rice protoplasts.Chin J Biotech,2014, 30(11):1751?1762.

Suppo rted by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2011CB100703),National Natural Science Foundation of China(Nos.31370161,31030008).

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2011CB100703)，國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos.31370161,31030008)資助。

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