馮 旭，汪家春，趙 龍，陳 虹，刁 琢，儲(chǔ)智勇

·論著·

冬蟲夏草口服液微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證

馮 旭，汪家春，趙 龍，陳 虹，刁 琢，儲(chǔ)智勇

目的 建立冬蟲夏草口服液微生物限度檢查方法，并對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。方法 采用常規(guī)法，通過大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念球菌、黑曲霉5種陽性菌回收率試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)控制菌檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 采用常規(guī)法計(jì)數(shù)細(xì)菌、霉菌及酵母菌時(shí)，各試驗(yàn)菌回收率在70%以上;控制菌檢查中，各陽性試驗(yàn)菌均檢出，陰性對(duì)照無菌生長(zhǎng)。結(jié)論 可以采用常規(guī)法進(jìn)行冬蟲夏草口服液的微生物限度檢查。

冬蟲夏草口服液;微生物限度檢查;方法驗(yàn)證

冬蟲夏草口服液是由中國(guó)人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所研制，以野生冬蟲夏草及人工培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體為原料生產(chǎn)的口服液制劑，具有滋陰補(bǔ)陽、益氣補(bǔ)血的功效，可用于腫瘤患者放療、化療的輔助治療。根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版(一部)微生物限度檢查法規(guī)定，在建立藥品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法和控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測(cè)定和控制菌檢查［1］。為更好地保證冬蟲夏草口服液的安全性和療效，本實(shí)驗(yàn)對(duì)冬蟲夏草口服液進(jìn)行了微生物限度檢查的方法驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品和培養(yǎng)基

冬蟲夏草口服液(規(guī)格:10 ml/瓶，海軍醫(yī)學(xué)研究所，批號(hào):20130402、20130301、20130109);營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸蛋白胨培養(yǎng)基(MUG)、蛋白胨均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 菌株

大腸埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B) 44102］，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26003］，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］，白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(B)98001］，黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(B)98003］均購(gòu)自上海食品藥品檢驗(yàn)所。

1.1.3 儀器

恒溫培養(yǎng)箱，生化培養(yǎng)箱，電子天平，高壓蒸汽滅菌器，凈化工作臺(tái)，三用紫外分析儀。

1.2 方法

1.2.1 供試液和菌液的制備

按文獻(xiàn)［2］制成1∶10的供試液備用。按文獻(xiàn)［2］制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉的菌懸液，50～100 cfu/ml。

1.2.2 細(xì)菌、霉菌及酵母菌回收率檢測(cè)

1.2.2.1 驗(yàn)證方法 采用平皿法，每個(gè)菌種的計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證分為供試品試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組和稀釋劑對(duì)照組。(1)供試品試驗(yàn)組:取1∶10供試液1 m l，及各50～100 cfu的試驗(yàn)菌1 ml，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;白色念珠菌、黑曲霉傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。(2)菌液組:取上述制備菌液各1 m l注入平皿中，傾注相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基。(3)供試品對(duì)照組:取上述1∶10供試液1 m l注入平皿中，傾注相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基。(4)稀釋劑對(duì)照組:取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液1 m l及各50～100 cfu的試驗(yàn)菌1 m l，分別注入平皿中，傾注相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基。將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在34℃下培養(yǎng)48 h，將白色念珠菌、黑曲霉在27℃下培養(yǎng)72 h，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。計(jì)算回收率，試驗(yàn)組菌數(shù)回收率=(試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)－供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù))÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%，稀釋劑對(duì)照組菌數(shù)回收率=(稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)÷菌液組的平均菌落數(shù))×100%。

1.2.2.2 樣品細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查 取批號(hào)為20130402、20130301、20130109的樣品各10 ml，分別加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，作為1∶10的供試液。取1∶10供試液10ml，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，作為1∶100的供試液。吸取各稀釋級(jí)供試液各1 ml至無菌平皿中，每一稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少注2～3個(gè)平皿，細(xì)菌計(jì)數(shù)使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)使用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。另取4 ml試驗(yàn)用稀釋劑(pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液)分別注入4個(gè)平皿中(即1 ml/皿)，其中2個(gè)作細(xì)菌數(shù)陰性對(duì)照，另2個(gè)作霉菌、酵母菌數(shù)陰性對(duì)照?；靹?，細(xì)菌計(jì)數(shù)平板倒置于34℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)平板倒置于27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。

1.2.3 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

1.2.3.1 菌種選擇 冬蟲夏草口服液為中藥口服液體制劑，不含生藥原粉，按《中國(guó)藥典》2010年版附錄微生物限度檢查法中的有關(guān)控制菌檢查方法，應(yīng)檢查大腸埃希菌，陰性對(duì)照菌為金黃色葡萄球菌。

1.2.3.2 菌液和供試液的制備 菌液按“1.2.1”方法制備，菌數(shù)控制在10～100 cfu/ml。供試液按“1.2.1”方法制備。

1.2.3.3 驗(yàn)證方法 取1∶10供試液10 ml加入到100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，再加入10～100 cfu大腸埃希菌懸液作為試驗(yàn)組;取1∶10供試液10 ml加入到100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，再加入10～100 cfu金黃色葡萄球菌懸液作為陰性菌對(duì)照組;取1∶10供試液10 ml加入到100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中作為供試品對(duì)照組，在34℃培養(yǎng)18～24 h。取上述各培養(yǎng)物0.2 m l，接種至含5 m l MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)，于5、24 h在366 nm紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照，若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性，若不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌回收率結(jié)果

采用常規(guī)法檢查冬蟲夏草口服液對(duì)5株菌的抑菌活性，結(jié)果試驗(yàn)組菌數(shù)回收率均＞70%，說明本品無明顯抑菌活性，可用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查。見表1。

2.2 樣品細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查結(jié)果

結(jié)果表明，20130402、20130301、20130109 3批樣品按驗(yàn)證方法檢查，細(xì)菌、霉菌或酵母菌總數(shù)均小于10 cfu/ml，符合規(guī)定。

2.3 控制菌檢查法驗(yàn)證結(jié)果

觀察后，沿管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色為靛基質(zhì)陽性，呈試劑本色為靛基質(zhì)陰性。結(jié)果顯示，控制菌檢查陽性菌生長(zhǎng)良好，陰性菌均未檢出，說明冬蟲夏草口服液對(duì)大腸埃希菌沒有抑制作用，可用常規(guī)法進(jìn)行檢驗(yàn)。見表2。

表1 常規(guī)法各查得試驗(yàn)菌株的回收率(%)

表2 各組控制菌檢查法驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

中國(guó)藥典2010年版微生物限度檢查法中規(guī)定:微生物限度檢查回收率試驗(yàn)中，若試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%，照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)法對(duì)冬蟲夏草口服液進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)測(cè)定，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率試驗(yàn)均高于70%，說明可直接采用常規(guī)法對(duì)冬蟲夏草口服液進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的計(jì)數(shù)。

在控制菌檢查試驗(yàn)中，試驗(yàn)組檢出大腸埃希菌，陰性菌對(duì)照組未檢出金黃色葡萄球菌，說明常規(guī)法可用于冬蟲夏草口服液的控制菌大腸埃希菌檢查。因此，可以直接采用常規(guī)法對(duì)冬蟲夏草口服液進(jìn)行微生物限度檢查。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典:第一部［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:79-88，138.

［2］ 中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:351-407.

［3］ 何進(jìn)，顧明業(yè)，高軍，等.桃紅四物口服液微生物限度檢查的方法驗(yàn)證［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26(4):371-373.

［4］ 許華玉，杜蕓，錢文靜.藥品微生物限度檢查法中細(xì)菌和真菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)［J］.中國(guó)中藥雜志，2005，30(24): 1918-1920.

Verification ofm icrobial lim it test for the Cordyceps sinensis oral liquid

FENG Xu，WANG Jia-chun，ZHAO Long，CHEN Hong，DIAO Zhuo，CHU Zhi-yong

(Naval Medical Research Institute，Shanghai200433，China)

Objective To establish amethod ofmicrobial limit test for Cordyceps sinensis oral liquid and to verify the validity of the testingmethod.Methods Conventionalmethodswere used to verify the countingmethods formicrobial，fungus and yeast counts through themeasurement of the recovery rates of5 positive bacteria in the Cordycepssinensis oral liquid.At the same time，the detection method for the control bacteria in the Cordyceps sinensis oral liquid was also verified.Results When conventional detection methods were used，the recovery rates of various bacteriawere over70%.In the detection of the control bacteria，positive testbacteriawere all detected，while no bacterial growth was detected in the control.Conclusion Conventionalmethods could be used for the detection of microbial limit in the Cordyceps sinensis oral liquid.

Cordyceps sinensis oral liquid;Microbial limit test;Verification of themethod

R284.1

A

10.3969/j.issn.1009－0754.2014.06.003

2014－02－06)

(本文編輯:張陣陣)

全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科技基金(14TG0295)

200433 上海，海軍醫(yī)學(xué)研究所(馮旭、汪家春、儲(chǔ)智勇);天津科技大學(xué)(趙龍、陳虹、刁琢)

儲(chǔ)智勇，電子信箱:zhiyongchuleader@163.com