汶文瑾，劉昌華，李曉艷，馬伊博，高澤紅

(大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622)

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是許多心、腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)［1，2］。雖然關(guān)于AS發(fā)生機(jī)制的學(xué)說(shuō)很多，但其具體的發(fā)病機(jī)理尚未完全明了［3，4］。在經(jīng)歷的一個(gè)半世紀(jì)的研究中，主要圍繞三種學(xué)說(shuō):脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、血栓形成學(xué)說(shuō)以及損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)。現(xiàn)代理論普遍認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)慢性炎癥性疾?。?］，隨著對(duì)AS免疫機(jī)制的深入了解，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在AS斑塊中具有許多炎癥反應(yīng)被激活的特征，其中單核細(xì)胞異常并進(jìn)入血管壁已被視為AS發(fā)生的關(guān)鍵性步驟［6，7］。

細(xì)胞膜流動(dòng)性(membrane fluidity)是細(xì)胞膜最顯著的結(jié)構(gòu)特征之一，是由磷脂雙分子層和蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)，包括縱向和橫向運(yùn)動(dòng)而形成。其動(dòng)力學(xué)變化與細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞免疫、細(xì)胞分化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等密切相關(guān)［8］，從而影響細(xì)胞的正常生理功能。近年來(lái)普遍采用熒光光漂白后恢復(fù)(FRAP)檢測(cè)細(xì)胞膜流動(dòng)性［9］，理論上活細(xì)胞生理過(guò)程中的任何分子，只要能用熒光標(biāo)記，就可以利用FRAP技術(shù)對(duì)它進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀測(cè)［10］。通過(guò)熒光漂白后的猝滅區(qū)域的恢復(fù)情況，揭示該細(xì)胞膜上分子遷移的方向、速度、比例等信息［11］。

本實(shí)驗(yàn)以動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的模型組和對(duì)照組兔外周血單核細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，利用FRAP直接檢測(cè)其流動(dòng)性，結(jié)合病理切片，以揭示AS影響單核細(xì)胞膜的流動(dòng)性，同時(shí)也為AS的病理機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為AS的臨床診斷、預(yù)防治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性新西蘭白兔，2.0 Kg左右，2月齡，購(gòu)自大連大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 主要藥品與試劑

10831兔單核細(xì)胞分離液購(gòu)自Sigma公司;DiI(細(xì)胞膜紅色熒光探針)購(gòu)自碧云天;PBS緩沖液、甲醇、乙醇、1640培養(yǎng)基、膽酸鈉、膽固醇均購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司;豬油、蛋黃粉、基礎(chǔ)飼料由大連大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供;DiI儲(chǔ)備液:1 mg DiI+1 mL DMSO，漩渦震蕩，－20℃下保存，用時(shí)取10 μL溶于1 mL PBS中;高脂飼料:0.5%膽酸鈉+1%膽固醇+5%豬油+15%蛋黃粉+78.5%基礎(chǔ)飼料［12］。

1.3 主要儀器

數(shù)顯電熱恒溫水浴箱;電子天平;冷凍離心機(jī);低速離心機(jī);倒置顯微鏡;MLS-3750高壓滅菌鍋;PHS-3TC數(shù)顯PH計(jì);SIM-F124制冰機(jī);202-2A型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱;CA-1480-2超凈工作臺(tái);FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 模型動(dòng)物(兔子)動(dòng)脈粥樣硬化模型建立

雄性新西蘭白兔20只，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組:正常對(duì)照組(Ⅰ組)4只，喂飼標(biāo)準(zhǔn)普通飼料;模型組(Ⅱ組)16只，喂飼高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)。每日每只進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)按照30～80 g/kg，自由飲水。飼養(yǎng)條件:按清潔級(jí)動(dòng)物分籠喂養(yǎng)，溫度18～24℃，濕度70%，光暗周期12 h。

1.5 兔外周血單核細(xì)胞分離

按常規(guī)兔外周血單核細(xì)胞分離方法分離單核細(xì)胞，取兔外周血與PBS按比例 1∶1混合。將PBS與全血混合液緩慢滴加在分離液上層，水平離心2300 r/min，30 min。棄上清，取位于中層的乳白色環(huán)狀液體于新的離心管(注意盡量不要吸到下層紅細(xì)胞)，依次加入8 mL，6 mL，5 mL PBS洗滌三次，水平離心1800 r/min，15 min。將得到的單核細(xì)胞懸浮于1640培養(yǎng)基，分裝于共聚焦培養(yǎng)皿，37℃，0.5%CO2爬片培養(yǎng)2 h。

1.6 兔外周血單核細(xì)胞膜流動(dòng)性功能檢測(cè)

取出共聚焦培養(yǎng)皿，倒置顯微鏡觀察爬片效果后，棄培養(yǎng)基，用 PBS洗滌2-3次，每次5 min;加入DiI工作液1 mL，避光孵育5-10 min;棄染色液，用PBS洗滌2-3次，每次5 min;洗滌完后加入1 mL PBS，上機(jī)檢測(cè);細(xì)胞膜流動(dòng)性能力檢測(cè):倒置顯微鏡(物鏡 ×60)觀察所要檢測(cè)的細(xì)胞，用 FV1000的stimulus setting程序進(jìn)行漂白設(shè)定。儀器參數(shù)如下:熒光染料激發(fā)波長(zhǎng)543 nm，接受波長(zhǎng)565 nm，熒光漂白波長(zhǎng)488 nm，功率30%，漂白時(shí)間1 s。選定漂白區(qū)域和對(duì)照區(qū)域，漂白前掃描2幀圖像，總共掃描100幀，約120 s，所有測(cè)量在室溫下進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)處理

計(jì)算機(jī)給出選定細(xì)胞在漂白前后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度曲線圖，據(jù)此計(jì)算擴(kuò)散系數(shù)D(diffusion coefficient)及熒光恢復(fù)率 R(recovery)。計(jì)算公式［13］如下:

其中β為矯正系數(shù)，ω為漂白區(qū)域半徑，t1/2為熒光恢復(fù)的一半時(shí)間。

其中F1為漂白恢復(fù)后的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)2為漂白前的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0為漂白后即刻熒光強(qiáng)度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 組織切片

動(dòng)脈硬化發(fā)生時(shí)單核細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞遷入內(nèi)膜，形成的巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL形成泡沫細(xì)胞，并隨后壞死崩解，形成粥樣斑塊。模型組動(dòng)脈切片中明顯可見(jiàn)動(dòng)脈內(nèi)膜局部增厚，內(nèi)有大量泡沫細(xì)胞聚集，深層為一些壞死物質(zhì)、沉積的脂質(zhì)和膽固醇結(jié)晶裂隙。對(duì)照組兔主動(dòng)脈表面平滑，內(nèi)皮細(xì)胞排列平整(圖 1、2)。

圖1 取兔胸主動(dòng)脈組織切片后HE染色觀察(×4)Fig.1 HE dyeing observation of rabbit thoracic aorta tissue slice(×4)

圖2 取兔主動(dòng)脈弓組織切片后HE染色觀察(×40)Fig.2 HE dyeing observation of rabbit bow aorta tissue slice(×40)

2.2 細(xì)胞膜流動(dòng)性檢測(cè)

2.2.1 熒光漂白后恢復(fù)過(guò)程 DiI是一種親脂性的膜染料，進(jìn)入細(xì)胞膜后可以側(cè)向擴(kuò)散逐漸使整個(gè)細(xì)胞膜被染色，經(jīng)激光共聚焦掃描顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行斷層掃描成像，得到細(xì)胞的熒光圖片(圖3)。圖中標(biāo)記處代表漂白區(qū)。發(fā)現(xiàn)漂白即刻，漂白區(qū)域的熒光強(qiáng)度明顯降低，而圖中其他細(xì)胞熒光強(qiáng)度沒(méi)有發(fā)生明顯變化，而漂白恢復(fù)后漂白區(qū)域的熒光強(qiáng)度有所回升。

2.2.2 擴(kuò)散系數(shù)及熒光恢復(fù)率的計(jì)算與比較細(xì)胞的擴(kuò)散系數(shù)及熒光恢復(fù)率可以反映細(xì)胞膜的流動(dòng)性。由表1和表2可以看出對(duì)照組的熒光恢復(fù)率和擴(kuò)散系數(shù)都比模型組高，且二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。故對(duì)照組單核細(xì)胞細(xì)胞膜流動(dòng)性比模型組單核細(xì)胞高。

表1 對(duì)照組和模型組單核細(xì)胞熒光恢復(fù)率(±s)Tab.1 Mononuclear cell fluorescence recovery rate in normal group and high-fat group(±s)

表1 對(duì)照組和模型組單核細(xì)胞熒光恢復(fù)率(±s)Tab.1 Mononuclear cell fluorescence recovery rate in normal group and high-fat group(±s)

N Fluorescence recovery對(duì)照組單核細(xì)胞6 61.02%+0.045模型組單核細(xì)胞 6 30.46%+0.089*

表2 對(duì)照組和模型組單核細(xì)胞擴(kuò)散系數(shù)(±s)Tab.2 Mononuclear cell diffusion coefficient in normal group and high-fat group(±s)

表2 對(duì)照組和模型組單核細(xì)胞擴(kuò)散系數(shù)(±s)Tab.2 Mononuclear cell diffusion coefficient in normal group and high-fat group(±s)

注:同對(duì)照組比較，*P ＜0.05

N Diffusion coefficient(×10-10 cm2/s)1.43+0.516模型組單核細(xì)胞 6 0.91+0.147對(duì)照組單核細(xì)胞6*

3 討論

圖3 熒光漂白恢復(fù)過(guò)程示意圖Fig.3 Process of fluorescent bleaching recovery

細(xì)胞膜流動(dòng)性(fluidity)是指細(xì)胞膜具有類似于液體那樣流動(dòng)的物理性質(zhì)，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是分子排列的液晶態(tài)特性，細(xì)胞膜流動(dòng)性是細(xì)胞重要的動(dòng)力學(xué)特征，與生物體的生命活動(dòng)密切相關(guān)［8］。細(xì)胞膜流動(dòng)性的變化會(huì)造成細(xì)胞生物功能的紊亂，影響脂類、膜蛋白以及糖鏈之間的相互作用，從而影響到細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖、免疫和信息傳遞等正常生理活動(dòng)［14］。而影響膜流動(dòng)性的主要因素有細(xì)胞膜本身的組分包括膜上膽固醇含量、脂肪酸鏈的飽和度和鏈長(zhǎng)、卵磷脂/鞘磷酯比例、膜蛋白的含量等［15］、環(huán)境因子及外源分子等。本文通過(guò)FRAP技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜流動(dòng)性，發(fā)現(xiàn)模型組單核細(xì)胞的熒光恢復(fù)率、擴(kuò)散系數(shù)比對(duì)照組單核細(xì)胞低，表明模型組單核細(xì)胞的膜流動(dòng)性低于對(duì)照組。有學(xué)者報(bào)道對(duì)照組的單核細(xì)胞和模型組的單核細(xì)胞的細(xì)胞骨架、膜脂成分、膜不對(duì)稱性等方面都存在著顯著的差異［15］，而以上因素均影響單核細(xì)胞膜流動(dòng)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，可能由于膜組分和結(jié)構(gòu)的改變或非膜分子的結(jié)合，引起了膜有序結(jié)構(gòu)的紊亂［16］，導(dǎo)致膜流動(dòng)性的變化，影響了細(xì)胞的正常功能。為證明單核細(xì)胞膜流動(dòng)性是由于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生變化，對(duì)模型組和對(duì)照組兔子解剖，取主動(dòng)脈進(jìn)行組織切片，發(fā)現(xiàn)模型組兔主動(dòng)脈切片出現(xiàn)明顯粥樣斑塊，斑塊中有大量聚集的泡沫細(xì)胞和細(xì)胞外脂質(zhì)及壞死物，高倍鏡下又可觀察到有膽固醇結(jié)晶和鈣化等動(dòng)脈粥樣硬化病理現(xiàn)象。結(jié)合模型組單核細(xì)胞的膜流動(dòng)性顯著低于對(duì)照組單核細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)由于動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，引起單核細(xì)胞膜表面發(fā)生變化，從而使模型組的單核細(xì)胞膜流動(dòng)性降低。此結(jié)果為進(jìn)一步研究單核細(xì)胞膜蛋白結(jié)構(gòu)的變化與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系提供數(shù)據(jù)。

［1］沈翔宇，田國(guó)良，于洋.關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的探討［J］.中外醫(yī)學(xué)研究，2010，8(9):34-35.SHEN Xiangyu，TIAN Guoliang，YU Yang.Research on the pathogenesis of atherosclerosis［J］.Chinese and Foreign Medical Research，2010，8(9):34-35.

［2］梁萍，胡長(zhǎng)林，冉海濤，等.頸動(dòng)脈粥樣硬化與缺血性腦血管病的臨床研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2009，38(16):2027-2028，2031.LIANG Ping，HU Changlin，RAN Haitao，et al.Clinical research of carotid artery atherosclerosis and ischemic cerebrovascular disease［J］.Chongqing Medicine，2009，38(16):2027-2028，2031.

［3］LIBBY P，RIDKER P M，MASERI A.Inflammation in therosclerosis［J］.Circulation，2002，105(9):1135-1143.

［4］李薇，杜軍保.動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2009，24(1):58-60.LI Wei，DU Junbao.Research progress of pathogenesis of atherosclerosis［J］.Journal of Applied Clinical Pediatrics，2009，24(1):58-60.

［5］徐也魯.動(dòng)脈粥樣硬化-一種慢性炎癥過(guò)程［J］.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2001，9(2):93-95.

［6］馬雅鑾，藺潔，秦明照，等.單核-巨噬細(xì)胞亞型與動(dòng)脈粥樣硬化［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2010，5(5):658-660.

［7］范樂(lè)明.動(dòng)脈粥樣硬化炎癥機(jī)制的再認(rèn)識(shí)［J］.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2005，13(3):249-253.

［8］高永貴，姚善徑，楊賢強(qiáng).DPH標(biāo)記法研究自由基對(duì)活細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響［J］.化工學(xué)報(bào)，2000，51(S1):182-185.GAO Yonggui，YAO Shanjing，YANG Xianqiang.Effect of free radicals on intact cell membrane fluidity by DpHlabeled［J］.Journal of Chemical Industry and Engineering(China)，2000，51(S1):182-185.

［9］YGUERABIDE J，SCHMIDT J A，YGUERABIDE E E.Lateral mobility in membranes as detected by fluorescence recovery after photobleaching［J］.Biophys J，1982，40(1):69-75.

［10］張志毅，周濤，鞏偉麗，等.熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)及其在活細(xì)胞分子機(jī)制研究中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通訊，2008，19(4):635-637.ZHANG Zhiyi，ZHOU Tao，GONG Weili，et al.Fluorescence recovery after photobleaching and its applications in the study of cellular molecular mechanics［J］.Letters in Biotechnology，2008，19(4):635-637.

［11］WOLF D E.Designing，building，and using a fluorescence re-covery after photobleaching instrument［J］.Methods Cell Biol，1989，30:271-306.

［12］張美玲，王茁伉，彭成.動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型研究進(jìn)展［J］.四川動(dòng)物，2009，28(5):794-797.ZHANG Meiling，WANG Zhuokang，PENG Cheng.A review on the atherosclerosis animal model［J］.Sichuan Journal of Zoology，2009，28(5):794-797.

［13］AXELROD D，KOPPEL D E，SCHLESSINGER J，et al.Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics［J］.Biophys J，1976，16(9):1055-1069.

［14］SHINITZKY M，INBAR M.Microviscosity parameters and protein mobility in biological membranes［J］.Biochim Biophys Acta，1976，433(1):133-149.

［15］張玲，孫樹(shù)秦，沈曉京，等.膜流動(dòng)性與動(dòng)脈粥樣硬化［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2001，7(1):56-58.

［16］周晉，陳奕，丁健.整合素的活化調(diào)控［J］.生命科學(xué)，2006，18(3):233-238.ZHOU Jin，CHEN Yi，DING Jian.The regulation of integrin activation［J］.Chinese Bulletin of Life Sciences，2006，18(3):233-238.