張 霞，張書泰，謝順昌，杜希萍，2，3，李利君，2，3*

(1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021;3.福建省高校食品微生物與酶工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

甲基對(duì)硫磷(簡(jiǎn)稱PM)又稱甲基1605，是一類目前廣泛使用的高效、高毒的有機(jī)磷農(nóng)藥，其主要中間代謝產(chǎn)物為對(duì)硝基苯酚(ρ-nitrophenol，PNP)，易溶于水，具有中等毒性。在PM降解成PNP過程中，農(nóng)藥的毒性降低了幾十甚至上百倍。但是，由于二者都具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，殘留期很長(zhǎng)，給環(huán)境和人類健康帶來潛在的威脅［1-3］。因此，研究有機(jī)磷農(nóng)藥的降解具有廣泛的應(yīng)用前景和應(yīng)用價(jià)值。

目前，有機(jī)磷的降解途徑主要有光催化降解、化學(xué)降解和微生物降解。光催化降解和化學(xué)降解會(huì)造成二次污染且作用效果慢，而微生物能將農(nóng)藥從大分子化合物降解為小分子化合物，最終成為H2O和CO2，實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境的無害化降解［4］。在20世紀(jì)40年代后已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)，已發(fā)現(xiàn)能降解甲基對(duì)硫磷的微生物有:鄰單胞菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、節(jié)桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、木霉屬等［5］。這些分離得到的菌株大部分為細(xì)菌，而在真菌對(duì)該農(nóng)藥的降解方面研究相對(duì)較少。李樹彬［6］、劉玉煥［7］等研究認(rèn)為真菌對(duì)農(nóng)藥的降解具有非常重要的作用。目前廣泛研究的生物反應(yīng)器大多采用細(xì)菌作為微生物主體處理污染物。由于細(xì)菌需要在較濕潤(rùn)、中性pH的環(huán)境下生長(zhǎng)，對(duì)于水溶性好的有機(jī)物去除率較高，但對(duì)于水溶性差和酸性氣體或有酸性物質(zhì)積累的環(huán)境下，就很難達(dá)到處理效果。真菌形態(tài)上多數(shù)是菌絲結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的穿透力和降解能力，對(duì)于干燥環(huán)境和強(qiáng)酸性環(huán)境具有較強(qiáng)的耐受能力。因此真菌在處理有機(jī)污染物方面具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)室從有機(jī)磷農(nóng)藥污染的土壤里采樣，以PM為磷源配制培養(yǎng)基，分離得到了一株真菌，實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為JMUPMD-1，本文利用rDNA ITS分子序列分析和表觀形態(tài)及生理生化鑒定方法進(jìn)行鑒定，檢測(cè)其降解PM的特點(diǎn)，為以后相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

(1)從受有機(jī)磷農(nóng)藥污染的土壤采集樣品，稱取10 g土樣接入100 mL選擇培養(yǎng)基中，在30℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)7 d，以10%接種量轉(zhuǎn)接到新鮮選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d后，再次以10%接種量接種于新鮮選擇培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)。

(2)取第3次富集所得培養(yǎng)液1 mL，將適合濃度的稀釋液0.1 mL涂布于選擇性固體培養(yǎng)基上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-8 d。

(3)挑取選擇平板上的單菌落進(jìn)行平板劃線分離，純化并保種。

1.1.2 主要試劑 50%甲基對(duì)硫磷乳油購(gòu)買于福建建甌福農(nóng)化工有限公司，40%樂果乳油購(gòu)買于山東嘉誠(chéng)農(nóng)藥化工有限公司，80%敵敵畏乳油購(gòu)買于福建三農(nóng)集團(tuán)股份有限公司，甲基對(duì)硫磷標(biāo)準(zhǔn)品濃度100 μg/mL，購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所。乙酸乙酯(色譜純)，購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司，酵母基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，購(gòu)自TIANGEN公司，DNA 凝膠回收試劑盒 DW02-2、dNTPs、Taq酶、10×PCR Buffer均購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。ITS1、ITS4 通用引物濃度 25 μmol/L，由上海鼎安生物科技有限公司合成。其它實(shí)驗(yàn)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ITS序列的PCR擴(kuò)增、測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析 將JMUPMD-1菌株分別在PDA平板和麥芽汁平板上劃線接種，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體，按照酵母基因組DNA提取試劑盒說明書所述步驟提取JMUPMD-1菌株總DNA，并以此為模板用ITS的通用引物 ITS1:5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'和ITS4:5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增［8］。PCR 擴(kuò)增體系:超純水 16.2 μL、10 × PCR buffer 2.0 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)1.0 μL、ITS1(25 μmol/L)0.2 μL、ITS4(25 μmol/L)0.2 μL、DNA模板 0.2 μL、Taq 酶(2.5 U/μL)0.2 μL。PCR 條件:96℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72℃后延伸10 min?；厥誔CR產(chǎn)物由英駿生物公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行同源比對(duì)。BLAST搜索GenBank數(shù)據(jù)庫中與該序列相似性較高的典型菌株的序列，ClustalX多序列比對(duì)，用 MEGA4.1中的 Neighbor-Joining(NJ)和Maximum Parsimony(MP)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

1.2.2 JMUPMD-1菌株的生理生化特性

(1)葡萄糖發(fā)酵［9］將含有指示劑的葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于試管中，裝液量10 mL，每管內(nèi)放一倒置的德漢氏小管，使其充滿培養(yǎng)基，112℃滅菌30 min。接種JMUPMD-1菌株，不接菌為空白對(duì)照，不加糖接種為陰性對(duì)照，并以釀酒酵母作為陽性對(duì)照，28℃靜置培養(yǎng)培養(yǎng)48 h后開始觀察，觀察1周。如果培養(yǎng)基顏色變黃且有氣泡產(chǎn)生，為發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，為發(fā)酵型;否則為不發(fā)酵葡萄糖型。

(2)碳源同化實(shí)驗(yàn)［9］預(yù)先配制好YNB液體培養(yǎng)基，以0.5%比例分別加入赤蘚糖醇，半乳糖醇，乳糖，蜜二糖，0.22 μm 濾膜過濾除菌。分別接種JMUPMD-1菌株，以添加葡萄糖不接種作為空白對(duì)照，28℃190 rpm搖床培養(yǎng)7 d，試管中培養(yǎng)液變混濁記為陽性，否則記為陰性。結(jié)果觀察標(biāo)準(zhǔn):將已培養(yǎng)數(shù)天的試管振蕩均勻。在一張白色卡片上畫上一條約3/4 mm寬的線，將卡片緊靠試管，對(duì)著自然光觀察，如果試管中溶液的混濁度將線掩蓋或變模糊，記此結(jié)果為+;如果溶液非常澄清，則記為－，表示未有酵母生長(zhǎng)，即不能利用該碳源。

(3)尿素水解實(shí)驗(yàn)［10］按培養(yǎng)基配方配制不含尿素的培養(yǎng)基100 mL，121℃滅菌25 min，待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，將預(yù)先過濾除菌的0.5 g/L的尿素水溶液4 mL添加到培養(yǎng)基中，混勻后分裝到無菌試管中，放置斜面。接種JMUPMD-1菌株，不接菌為空白對(duì)照，接種釀酒酵母做陰性對(duì)照。28℃培養(yǎng)觀察7 d。如果培養(yǎng)基顏色變紅，說明菌株產(chǎn)生脲酶，分解尿素產(chǎn)氨變堿，記為陽性;否則為陰性。

(4)50%葡萄糖(w/w)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)［9］配制YPD培養(yǎng)基20 mL，加入0.4 g的瓊脂粉，稱量培養(yǎng)基的重量，加入等重的葡萄糖，加熱溶化后分裝入4根試管中，112℃滅菌30 min，放置斜面。接種JMUPMD-1菌株，不接菌為空白對(duì)照，28℃恒溫培養(yǎng)10 d。若能生長(zhǎng)則說明該菌能耐受高濃度的葡萄糖，不生長(zhǎng)則不能。

(5)硝酸鹽生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)［9］配制 YCB培養(yǎng)基100 mL，其中40 mL添加1%KNO3，30 mL加 1%硫酸銨作為陽性對(duì)照，剩余30 mL不加任何氮源作為陰性對(duì)照，0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝于無菌大試管中，每管約10 mL，接種菌株JMUPMD-1，并做空白對(duì)照。28℃搖床培養(yǎng)7 d，根據(jù)培養(yǎng)液的渾濁度分析判斷。

1.2.3 形態(tài)鑒定 菌株JMUPMD-1接種于MEA平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)。7 d后對(duì)菌落形態(tài)和顯微形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.2.4 甲基對(duì)硫磷的檢測(cè) 氣相色譜檢測(cè)條件:VARIAN CP-3800氣相色譜儀;色譜柱:HP-50毛細(xì)管柱，30 m × 530 μm × 1 μm;色譜柱 溫度:100 ℃(3 min)240℃(15 min);TSD檢測(cè)器溫度:300℃;進(jìn)樣口溫度:240℃;載氣:99.999%高純氮?dú)?，流?0 mL/min;氫氣5 mL/min;空氣175 mL/min;進(jìn)樣量 1 μL，分流比 30∶1。

分析測(cè)定方法:稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，取2 mL培養(yǎng)液，添加1 g NaCl充分渦旋、鹽析;加入等體積乙酸乙酯提取，充分振蕩，靜置30 min，分離乙酸乙酯相;無水Na2SO4脫水，N2吹干;加1 mL乙酸乙酯搖勻，氣相色譜檢測(cè)(圖1)。

圖1 JMUPMD-1菌株對(duì)甲基對(duì)硫磷降解的氣相色譜圖Fig.1 Degradation to parathion-methyl in the presence of JMUPMD-1 determined by Gas Chromatography(GC)

1.2.5 JMUPMD-1菌株對(duì)環(huán)境中甲基對(duì)硫磷降解的模擬試驗(yàn) 將JMUPMD-1菌株分別接種于選擇性液體培養(yǎng)基中，添加0.1%甲基對(duì)硫磷乳油為唯一磷源(培養(yǎng)液初始濃度約為350 μg/L)，以不接菌為對(duì)照組，在30℃下190 r/min培養(yǎng)7 d后，測(cè)定甲基對(duì)硫磷的濃度，計(jì)算JMUPMD-1菌株對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解率。

1.2.6 JMUPMD-1菌株甲基對(duì)硫磷降解酶液的制備及活性測(cè)定 分別制備三株菌的發(fā)酵上清液及胞內(nèi)提取液，加入適量的甲基對(duì)硫磷進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)后甲基對(duì)硫濃度變化。

胞外提取液:菌株液體培養(yǎng)至6 d時(shí)，取50 mL發(fā)酵液8000 r/min離心，上清即為胞外提取液。

胞內(nèi)提取液:收集上步離心后的菌體，用蒸餾水洗滌菌體3次，將菌體置入研磨內(nèi)，加入適量的石英砂，放入冰箱中預(yù)冷，然后充分研磨。反復(fù)預(yù)冷研磨3次后加入10 mL 50 mmol/L的pH6.8磷酸鹽緩沖液，全部轉(zhuǎn)移至離心管中，0-4℃條件下浸泡24 h，8000 r/min離心得上清，即為胞內(nèi)提取液。

反應(yīng)體系:30 μL濃度約為800 mg/L甲基對(duì)硫磷乳液，1950 μL 提取液(對(duì)照組為1950 μL 磷酸鹽緩沖液)，35 ℃下反應(yīng) 40 min，20 μL 6 mol/L HCl終止反應(yīng)。依據(jù)1.2.3的分析測(cè)定方法測(cè)定各反應(yīng)體系中甲基對(duì)硫磷的濃度，并計(jì)算對(duì)照組和提取液處理組40 min后甲基對(duì)硫磷的濃度減少量。運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定各組中甲基對(duì)硫磷降解的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 JMUPMD-1菌株rDNA ITS區(qū)域的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹

提取JMUPMD-1的DNA為模板，用酵母ITS區(qū)域通用引物ITS1和ITS4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)并對(duì)相應(yīng)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，共447個(gè)堿基，將序列提交到GenBank獲得登記注冊(cè)號(hào)為HM564395。利用BLAST軟件將所得基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示菌株JMUPMD-1與Candida blankii的同源性最高，達(dá)99%。收集與JMUPMD-1同源性較高的菌株序列，采用ClustslX進(jìn)行多序列匹配比對(duì)，通過MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，結(jié)果表明 JMUPMD-1菌株同 Candida blankii WM 0719(FM178304)和Candida blankii MUCL29808(EU343873)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，位于同一個(gè)分支。

圖2 菌株JMUPMD-1 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic tree derived from ITS sequences of strain JMUPMD-1

2.2 JMUPMD-1的生理生化特性

對(duì)JMUPMD-1菌株進(jìn)行系列生理生化實(shí)驗(yàn)，JMUPMD-1發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;赤蘚糖醇、半乳糖醇、乳糖和蜜二糖的同化實(shí)驗(yàn)表明JMUPMD-1可以同化赤蘚糖醇、半乳糖醇和乳糖，不能同化蜜二糖;尿素水解實(shí)驗(yàn)顯示該菌株不能產(chǎn)生尿酶，所以不能分解尿素使指示劑變色;JMUPMD-1菌株在50%的高濃度葡萄糖培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，呈陰性，說明高濃度葡萄糖對(duì)該菌株的生長(zhǎng)有很強(qiáng)抑制作用;JMUPMD-1在YPD培養(yǎng)基上于37℃條件下生長(zhǎng)良好;氮源同化實(shí)驗(yàn)中，以硫酸銨為唯一氮源的培養(yǎng)液變渾濁，以硝酸鉀為唯一氮源的培養(yǎng)液未見渾濁，表明JMUPMD-1不能同化硝酸鉀作為生長(zhǎng)氮源。JMUPMD-1生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總后同《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》中Candida blankii標(biāo)準(zhǔn)菌株比較(表2.4)，結(jié)果顯示JMUPMD-1的生理生化特性同Candida blankii標(biāo)準(zhǔn)菌株的特性基本相符，只有葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，JMUPMD-1可以發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，而Candida blankii標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)葡萄糖發(fā)酵是可變的、不確定的(V)，因此我們也認(rèn)為是相符的。

表1 JMUPMD-1生理生化特性Tab.1 Biochemical characteristics of JMUPMD-1

2.3 JMUPMD-1 的形態(tài)觀察

菌株JMUPMD-1在MEA平板28℃培養(yǎng)7 d后，菌落呈白色，表面光滑，中心隆起，致密不透明，邊緣整齊、羽毛狀，推測(cè)是假菌絲的的宏觀表現(xiàn)。正反面顏色一致，菌落直徑 為 0.6 cm(圖 3A)。取JMUPMD-1培養(yǎng)液進(jìn)行制片觀察，該菌單細(xì)胞為圓形，直徑 2.4-2.8 μm，有頂端出芽和三端出芽的繁殖方式(圖3B);取菌落邊緣制片觀察，發(fā)現(xiàn)該菌株具有假菌絲，寬約 2.75 μm，假菌絲上產(chǎn)生厚垣孢子(圖3C)。

圖3 JMUPMD-1的培養(yǎng)性狀及顯微特征Fig.3 Cultural and microscopic characteristics of strain JMUPMD-1

2.4 JMUPMD-1菌株降解甲基對(duì)硫磷能力和菌株提取液酶活測(cè)定

對(duì)JMUPMD-1菌株降解甲基對(duì)硫磷能力測(cè)定，甲基對(duì)硫磷由初始濃度350 μg/L降低至102.5 μg/L，降解率為 48.6% 。

對(duì)JMUPMD-1菌株的胞內(nèi)提取物和胞外提取物對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解酶活性測(cè)定，經(jīng)胞內(nèi)提取物處理40 min后，甲基對(duì)硫磷含量減少了3.3 mg/L，經(jīng)胞外提取液處理40 min的甲基對(duì)硫磷含量?jī)H減少0.36 mg/L。因此可以確定JMUPMD-1菌株發(fā)酵液上清無甲基對(duì)硫磷降解酶活性，胞內(nèi)提取液具有甲基對(duì)硫磷降解酶活性。

3 討論

甲基對(duì)硫磷作為有機(jī)磷殺蟲劑，具觸殺和胃毒作用，能抑制害蟲神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿酯酶的活力而使其致死，殺蟲譜廣，能防治水稻、棉花、果樹、茶葉、蔬菜等作物的多種害蟲，但其防治效果較低，使用時(shí)用量較大，因此治理甲基對(duì)硫磷的污染對(duì)于保證環(huán)境安全和人類健康都有重要的意義［11-15］。目前，對(duì)于甲基對(duì)硫磷的降解機(jī)理的研究已較為透徹，也有不少的相關(guān)報(bào)道。在相關(guān)的報(bào)道中，關(guān)于細(xì)菌對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解研究報(bào)道較多，真菌對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)室從集美大學(xué)附近土壤里分離到一株能以PM為磷源的真菌JMUPMD-1，經(jīng)鑒定該菌為布朗克假絲酵母菌，該菌不僅能在以甲基對(duì)硫磷為磷源的培養(yǎng)基中降解甲基對(duì)硫磷，即使在含有容易利用的磷源條件下(如K2HPO4)也可以降解甲基對(duì)硫磷。在該菌株培養(yǎng)基上清液未檢測(cè)出甲基對(duì)硫磷降解酶的活性，其所表達(dá)的甲基對(duì)硫磷降解酶為胞內(nèi)酶。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以350 μg/L甲基對(duì)硫磷為唯一磷源和350 μg/L甲基對(duì)硫磷及1 g/L K2HPO4組成的混合磷源培養(yǎng)該菌株，該菌降解率達(dá)48.6%，既豐富了甲基對(duì)硫磷降解菌廣譜，同時(shí)也為構(gòu)建工程菌提高降解酶的表達(dá)量，從而提高對(duì)農(nóng)藥的降解力和生產(chǎn)有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑奠定基礎(chǔ)。

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