張從宇，王 敏，李文陽，王停停，崔嘉欣

(1.安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院，安徽鳳陽 233100;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，安徽合肥 230036)

小麥富含蛋白質(zhì)，普通品種含量13%左右，變化范圍6.9-22%［1，2］。小麥生產(chǎn)的蛋白質(zhì)占所有谷類作物的1/3，蛋白質(zhì)含量是衡量小麥營養(yǎng)品質(zhì)的主要指標(biāo)［3，4］。小麥儲藏蛋白主要是醇溶蛋白和谷蛋白，谷蛋白是依靠二硫鍵結(jié)合的大分子蛋白聚合體，用SDS-PAGE分離，可分為高分子量亞基和低分子量亞基。研究表明，高分子量谷蛋白(GMP)含量、粒度及亞基的結(jié)構(gòu)與小麥加工品質(zhì)有密切關(guān)系［5，6］，GMP由高、低分子量谷蛋白亞基(HMW-GS、LMWGS)通過二硫鍵(S-S)連接并聚合而成，HMW-GS的組成影響GMP的形成，進(jìn)而影響面粉的加工品質(zhì)［7，8］。

60Co-γ射線是輻射育種最常用的射線源。并具有產(chǎn)生小麥品質(zhì)突變的特點(diǎn)。已有研究表明，利用60Co-γ射線輻射小麥，可提高蛋白質(zhì)含量和賴氨酸含量［9-12］。本試驗(yàn)用60Co-γ射線輻射小麥皖麥50的干種子，在M2代篩選HMW-GS組成變異單株，M3代測定其穗行變異穩(wěn)定性，并對變異穗行種子的GMP含量、GMP粒度、部分營養(yǎng)品質(zhì)和加工品質(zhì)進(jìn)行測定，篩選出了穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)變異種質(zhì)，具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為皖麥50，目前為安徽省主推小麥品種，2005通過國家審定，半冬性，幼苗半匍匐，苗期長勢壯，葉寬長，青綠色，分蘗力強(qiáng)，穗紡錘型，長芒，白殼，白粒，半角質(zhì)。國家區(qū)域試驗(yàn)2003年、2004年分別測定混合樣，品質(zhì)指標(biāo)平均為:容重802克/升，蛋白質(zhì)(干基)含量14.16%，濕面筋含量31.4%，沉降值25.8毫升，吸水率54.7%，面團(tuán)形成時間 2.2分鐘，穩(wěn)定時間2.0分鐘。HMW-GS組分為1A(Null)/1B(7+9)/1D(2+12)［13］。取當(dāng)年收的干種子作誘變對象。

1.2 輻照處理

用60Co-γ射線輻照皖麥50，劑量為200 Gy，處理種子1000粒，不處理的皖麥50為對照。

1.3 誘變材料的種植

輻射處理當(dāng)代種子于2011年秋播種，2012年夏每株收1穗，混脫，獲得M1代種子;2012年秋種植，行距20 cm，株距5 cm，種植1000株，2013年夏收獲單株，單穗脫粒，獲得M2代種子，本試驗(yàn)隨機(jī)收獲655個單株。M2代HMW-GS亞基變異株(株號282)的5穗種子播成穗行，成熟后收獲，獲得M3代種子。

1.4 M2代HMW-GS組成變異的篩選

采用高分子量麥谷蛋白亞基的電泳圖譜分析法。半粒種子磨粉后，加入50%異丙醇，60℃水浴下去除雜質(zhì)后，加入樣品提取液60℃水浴下提取1 h，加入樣品緩沖液，即可上樣或4℃冰箱保存。電泳采用SDS垂直板，分離膠為10%(pH8.5)，濃縮膠濃度為 3.75%(pH6.8)，膠厚 1.5 mm，樣品梳 16齒，每個樣品孔點(diǎn)樣20μL。電極緩沖液為Tris-甘氨酸(pH8.3)。以13 mA穩(wěn)流電泳，指示劑出膠后1 h停止電泳。凝膠用染色液(12.5%三氯乙酸+0.05%考馬斯亮蘭)染色過夜，用水脫色至背景清淅，用凝膠成像系統(tǒng)對膠照相，然后用Qualityone軟件進(jìn)行比較、分析。

655個M2代單株，每穗隨機(jī)選3粒種子進(jìn)行電泳，以皖麥50為對照，以HMW-GS的亞基條帶數(shù)量和比對中育8號(HMW-GS組成為1/7+9/2+12)［13］相對位置為依據(jù)鑒定變異。

1.5 M3代變異穗行HMW-GS組成穩(wěn)定性鑒定

M3代穗行種子每穗隨機(jī)選5粒，進(jìn)行 SDSPAGE電泳，以皖麥50為對照，鑒定HMW-GS組成變異的穩(wěn)定性。

1.6 M2代群體單株及M3代變異穗行種子部分營養(yǎng)和加工品質(zhì)的測定

M2代群體單株及M3代變異穗行種子，用瑞典波通公司的DA7200型近紅外谷物品質(zhì)分析儀，測定吸水率、蛋白質(zhì)含量、容重、濕面筋含量、穩(wěn)定時間、形成時間、硬度指數(shù)、沉降值、出粉率，3次重復(fù)。

1.7 M3代變異穗行種子GMP含量的測定

變異穗行種子，參照 Weegels P L的方法［7］，用雙縮脲法測定GMP含量。向0.05 g小麥粉中加入1mL 1.5%的SDS提取液，常溫下15500 g離心15 min，棄上清液，殘余物加入稀釋1倍的雙縮脲試劑10mL，振蕩2 h后離心，取上清液測540 nm處的吸光值，殘余物中的氮含量作為GMP的近似值，3次重復(fù)。

1.8 M3代變異穗行種子GMP凝膠提取及粒度的測定

變異穗行種子，參照Don C的方法提取GMP凝膠［14］。稱取3 g樣品，放入100mL燒杯中，加入60mL 1.5%的SDS溶液，混勻，80000 g離心30 min。取上層蛋白質(zhì)凝膠，用Bettersize 2000激光粒度分析儀進(jìn)行分析。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPS軟件分析統(tǒng)計(jì)，Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 M2代HMW-GS組成變異篩選結(jié)果

655個M2代單株，經(jīng)SDS-PAGE電泳篩選，株號為282的單株發(fā)生HMW-GS組分變異，變異率為0.15%，從圖1看，變異的亞基組分由皖麥50的的7+9/2+12變?yōu)?/7+9/2+12，1A染色體上多1條帶，1B和1D染色體上條帶未變，且282號單株5穗種子全為1/7+9/2+12變異類型。

圖1 單株282號的5個單穗籽粒M2代HMW-GS組成變異Fig.1 HMW-GS composition variation of M2generation of 5 singal spike grains of plant No.282

2.2 M2代 HMW-GS變異單株282號與 M2代群體及對照的農(nóng)藝性狀比較

從表1看，M2代HMW-GS變異單株282號的株高、穗長、小穗數(shù)、退化小穗數(shù)、單穗粒數(shù)、單穗粒重均比群體平均數(shù)和對照皖麥50小，而千粒重比群體高，低于對照，經(jīng)方差分析，差異均不顯著。從植株特性上看，變異單株282號屬半冬性，幼苗半匍匐，苗期長勢壯，葉寬長，青綠色，分蘗力強(qiáng)，穗紡錘型，長芒，白殼，白粒，這與對照皖麥50一致;從籽粒特性上看，變異單株282號屬角質(zhì)，透明，而對照皖麥50屬半角質(zhì)，半透明。

2.3 M2代 HMW-GS變異單株282號與 M2代群體及對照的品質(zhì)性狀比較

從表2看，M2代HMW-GS變異單株282號的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、形成時間、沉降值均比群體平均數(shù)和對照皖麥50高;而吸水率、直鏈淀粉含量比群體高，但低于對照;穩(wěn)定時間、硬度指數(shù)低于群體，但高于對照;出粉率低于群體和對照。經(jīng)方差分析，變異單株282號的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值與對照皖麥50差異極顯著，穩(wěn)定時間、形成時間、硬度、直鏈淀粉含量與對照皖麥50差異顯著。

表1 變異單株與M2代群體及對照的農(nóng)藝性狀Tab.1 Agronomic traits of mutation plant of M2groups and control

表2 變異單株與M2代群體及對照的品質(zhì)性狀Tab.2 Quality traits of mutation plant and M2groups and control

2.4 M3代變異穗行穩(wěn)定性鑒定結(jié)果

從圖2看，M3代5個穗行種子，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，HMW-GS組分全為1/7+9/2+12類型，和M2代為同一變異類型，穩(wěn)定不變。

2.5 M3代變異穗行籽粒品質(zhì)性狀測定結(jié)果

從表3看，5個變異穗行籽粒蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、穩(wěn)定時間、形成時間、沉降值均比對照皖麥50高;容重、直鏈淀粉變異4略高于皖麥50，變異穗行1、2、3、5 均低于皖麥 50;硬度指數(shù)變異穗行 1、5高于對照，變異穗系2、3、4低于對照。經(jīng)方差分析，變異單株282號的5個變異穗行的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值與皖麥50差異均達(dá)極顯著水平;變異穗行1、3、4、5穩(wěn)定時間與皖麥50差異極顯著;變異穗行2、3、4、5形成時間與皖麥50差異顯著，變異穗行1差異極顯著;變異穗行1直鏈淀粉含量與皖麥50差異顯著，變異穗行3、4差異極顯著。

圖2 單株282號的5個穗行籽粒M3代HMW-GS組成變異Fig.2 HMW-GS composition variation of M3generation of 5 ear row grains of plant No.282

表3 M3代變異穗穗行籽粒品質(zhì)性狀測定結(jié)果Tab.3 Determination results of grain quality traits of variation ear range of M3generation

2.6 M3代變異穗行籽粒GMP含量及GMP/Pr的測定結(jié)果

從圖 3 看，M3代變異穗行 1、2、3、4、5 籽粒 GMP含量均高于皖麥50，其中，變異穗行5最高。經(jīng)方差分析，變異單株282號的5個變異穗行GMP含量與皖麥50差異均極顯著。

從圖 4 看，M3代變異穗行 1、2、3、4、5 籽粒GMP/Pr均高于皖麥50，其中，變異穗行5最高。經(jīng)方差分析，變異單株282號的變異穗行1、2的GMP/Pr與皖麥50差異顯著，變異穗行3、4、5與皖麥50差異極顯著。

2.7 M3代變異穗行籽粒GMP粒徑及數(shù)目分布

從圖5看，皖麥50和各變異穗行籽粒GMP數(shù)目分布均呈單峰曲線。變異穗行1、2、3、4、5的粒徑分布范圍均大于皖麥50，最大分布區(qū)間的數(shù)值也大于皖麥50。皖麥50粒徑分布范圍為0.271-71.52μm，最大分布區(qū)間為0.715-0.911μm;變異穗行1、2、3、5粒徑分布范圍為 0.271-116.10μm，最大分布區(qū)間為0.911-1.161μm;變異穗行 4 粒徑分布范圍為 0.271-147.9μm 之間，最大分布區(qū)間為 0.911-1.161μm。

圖3 M3代變異穗行籽粒GMP含量的測定結(jié)果Fig.3 Determination results of content of GMP of variation ear row of M3generation

圖4 M3代變異穗行籽粒GMP/Pr的測定結(jié)果Fig.4 Determination results of GMP/Pr of variation ear row of M3generation

圖5 M3代變異穗行GMP粒徑分布區(qū)間及比例Fig.5 GMP paticle diameter distribution range and propotion of variation ear row of M3generation

從表 4 可以看出，變異穗行 1、2、3、4、5 籽粒，粒徑大于10.28μm的 GMP顆粒數(shù)目，比例均大于對照皖麥50。

表4 GMP數(shù)目分布(%)Tab.4 Number distribution of GMP(%)

3 討論

小麥營養(yǎng)品質(zhì)包括蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量等指標(biāo)，其測定值越大，營養(yǎng)越豐富;許多研究表明，蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量與硬度、沉降值、穩(wěn)定時間、形成時間均顯著相關(guān)［1］。新出臺的國家小麥品種品質(zhì)分類標(biāo)準(zhǔn)(GB/T17320-2013)［15］，依據(jù)小麥籽粒硬度指數(shù)、干基蛋白質(zhì)含量將小麥品種分為強(qiáng)筋、中強(qiáng)筋、中筋、弱筋4類，標(biāo)準(zhǔn)為強(qiáng)筋(干基蛋白含量≥14、硬度指數(shù)≥60)，中強(qiáng)筋(干基蛋白含量≥13、硬度指數(shù)≥60)，中筋(干基蛋白含量≥12.5、硬度指數(shù)≥50)，弱筋(干基蛋白含量 ＜12.5、硬度指數(shù) ＜50)。依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)中測定的皖麥50屬中強(qiáng)筋小麥，變異穗行均達(dá) 1、2、3、4、5 強(qiáng)筋標(biāo)準(zhǔn)，在品種分類上提升了一個檔次。小麥加工品質(zhì)包括硬度、沉降值、穩(wěn)定時間、形成時間等指標(biāo)，其測定值越大，加工品質(zhì)越好［1］。與國外同類品種相比，我國小麥品種的蛋白質(zhì)含量并不低，主要是蛋白質(zhì)組成較差，GMP含量低、粒徑小、優(yōu)質(zhì)亞基頻率較低是導(dǎo)致我國小麥整體面筋強(qiáng)度較低的主要原因［16，17］。跟據(jù)Payne等人根據(jù)單個亞基或亞基對與SDS沉淀值的關(guān)系提出的HMW-GS的品質(zhì)評分系統(tǒng)，亞基得分1(3 分)，7+9=2+12(2 分)，Null(1 分)［18］。依據(jù)Payne等的評分標(biāo)準(zhǔn)，皖麥50得分為5分，變異穗行1、2、3、4、5 得分均為7 分，變異穗行的加工品質(zhì)評分也顯著地提高。從沉降值、穩(wěn)定時間、形成時間看，變異穗行也比皖麥50明顯提升和優(yōu)化。

4 結(jié)論

60Co-γ射線可誘發(fā)皖麥50HMW-GS組成發(fā)生變異，變異率為0.15%;HMW-GS組分由皖麥50的7+9/2+12變?yōu)?/7+9/2+12，并在 M3代保持穩(wěn)定;M3代5個變異穗行，蛋白質(zhì)含量、GMP含量、GMP/Pr均比皖麥50提高，GMP粒徑分布范圍擴(kuò)大，粒徑大于10.28μm的比例增加;營養(yǎng)品質(zhì)和加工品質(zhì)都得到改善。

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