石凡華

(泰安市婦幼保健院，山東 泰安 271000)

羊水過少(oligohydramnios，OR)是胎兒在宮內(nèi)生長環(huán)境不佳的指征之一，圍生醫(yī)學的迅猛發(fā)展及超聲技術(shù)的不斷提高,生存環(huán)境及生活節(jié)奏的變化，臨床上羊水過少的診斷率及發(fā)生率明顯增加[1]。對圍產(chǎn)兒的不良影響日益受到產(chǎn)科工作者的重視。病因不明確，一般認為與胎兒畸形、胎盤功能異常及病理性妊娠如妊娠高血壓、胎兒生長受限、過期妊娠等因素有關(guān)[2]。目前對晚發(fā)單純OR的發(fā)生機理，尚缺乏有力的證據(jù)，而且對不同病理性妊娠的研究，多集中于胎盤，忽略了對孕晚期羊膜形態(tài)和功能的研究。本研究對羊膜和胎盤組織進行病理組織學及組織化學研究，目的是尋找在OR形成過程中的形態(tài)學證據(jù)。

1 材料和方法

1.1標本選擇與分組 選擇近年在泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院產(chǎn)科和泰安市婦幼保健院產(chǎn)科足月分娩產(chǎn)婦，其中羊水過少15例(OR組)，正常妊娠15例(對照組)。應(yīng)用羊水指數(shù)(AFI)法，羊水量產(chǎn)前超聲檢測提示AFI≤8.0 cm,破膜時羊水量少于300 ml確定為羊水過少。兩組產(chǎn)婦均為選擇性剖宮產(chǎn)，并排除內(nèi)科合并癥及其他產(chǎn)科并發(fā)癥，無藥物服用史，無縮宮素引產(chǎn)史及母體脫水等因素。

1.2標本采集與處理 每例標本取羊膜1.5 cm×1.5 cm各兩塊；胎盤取中央和邊緣部(距胎盤邊緣約1 cm)1.0 cm×1.0 cm×全厚各兩塊。所取材料迅速用生理鹽水沖洗，放入10%甲醛固定6～12 h后，前者修至約1.0 cm×1.0 cm，后者0.6 cm×0.6 cm×全厚，胎盤組織繼續(xù)固定24 h。梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片厚5 μm，隔5片取相鄰2片(每例共取6片)分別進行常規(guī)(HE)染色和組織化學甲基綠-派洛寧(DNA- RNA)染色，光鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計學處理 利用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行分析并比較組間差異，均數(shù)的比較采用兩獨立樣本t檢驗的方法，組織化學反應(yīng)強度的差異用完全隨機設(shè)計樣本比較的秩和檢驗。

2 結(jié) 果

DNA陽性反應(yīng)物定位于細胞核呈綠色，RNA主要定位在細胞質(zhì)，呈淡紅色。

2.1羊膜

光鏡下對照組和OR組5層結(jié)構(gòu)清晰可辨，依次為上皮細胞層(羊膜細胞)、基膜、致密層、纖維母細胞層和海綿層，平均厚度約0.5 mm。由于前兩層(羊膜細胞和基膜)與相鄰層連接疏松，常易與深層分離(圖1)。

對照組:羊膜細胞多呈立方形和低柱狀，細胞界限清楚，排列整齊緊密，平均高度為5.5 μm，胞質(zhì)呈均質(zhì)狀，HE染色弱嗜酸性；核橢圓形或圓形。DNA-RNA染色胞質(zhì)呈淡紅色，RNA陽性反應(yīng)，多數(shù)細胞核DNA弱陽性反應(yīng)，著色淺淡(圖1)。

OR組：羊膜細胞形態(tài)差別較大，從扁平形至寬大的高柱狀不等，以高低不同的柱狀為主，平均高度約為8.5 μm。胞質(zhì)呈泡沫狀，甚至大量空泡形成，核相對較小，其中2例上皮鱗狀化生(圖2)，2例羊膜表層纖維化，羊膜細胞胞質(zhì)極少，胞核固縮。DNA-RNA染色羊膜細胞胞質(zhì)RNA(派洛寧)著色淺淡，呈弱陽性；而核內(nèi)DNA(甲基綠)著色濃深，強陽性者居多。參照David及岳淑紅等[3]的分級標準，光鏡下對羊膜和胎盤絨毛DNA-RNA染色反應(yīng)產(chǎn)物強度劃分為5級，分別用0、+、++、+++、++++來表示。0級陰性或分辨不清；Ⅰ級有反應(yīng)但很弱,染色很淺；Ⅱ級反應(yīng)中等,介于1和3級之間；Ⅲ級反應(yīng)較強，染色深；Ⅳ級反應(yīng)最強,染色深重[4]。

對兩組DNA染色強陽性細胞計數(shù)，每張切片高倍鏡下(400倍)選取5個不重復視野，計數(shù)羊膜細胞總數(shù)和強陽性細胞數(shù)，最后計算平均百分數(shù)，結(jié)果如表1。

表1 羊膜和胎盤滋養(yǎng)細胞DNA-RNA組織化學反應(yīng)強度比較

注：秩和檢驗，羊膜：對照組與RO組比較P<0.05，胎盤兩組比較P<0.01。

圖1 對照組羊膜，細胞核DNA著色淺淡?！?00

圖2 OR組羊膜，上皮復層化生，細胞核DNA深染?！?00

2.2胎盤

在兩種染色的標本上，胎盤中央及邊緣部結(jié)構(gòu)無明顯差別，故不再分別描述。絨毛多被橫斷，絨毛壁上皮細胞滋養(yǎng)層較少不連續(xù)，以合體滋養(yǎng)細胞為主。

對照組：絨毛上皮合體細胞界限不清，合胞體結(jié)節(jié)(syncytail knot) 較多、深染。DNA-RNA染色滋養(yǎng)層細胞核以弱陽性者為主，胞質(zhì)呈陽性反應(yīng)(圖3)。

OR組：絨毛間隙與絨毛結(jié)構(gòu)與對照組相似，合體結(jié)節(jié)比對照組明顯增多、深染。絨毛中軸血管擴張，間質(zhì)水腫。滋養(yǎng)細胞，DNA-RNA染色滋養(yǎng)層細胞核強陽性者比對照組明顯增多，并可見較多核碎解現(xiàn)象，高度深染及核碎解者，符合凋亡細胞的形態(tài)學特征，多集中在合體結(jié)節(jié)處，胞質(zhì)呈RNA陽性反應(yīng)(圖4)，高倍鏡下對兩組凋亡細胞進行計數(shù)，計數(shù)方法同羊膜，結(jié)果見表2。

圖3 對照組胎盤絨毛橫斷面，滋養(yǎng)層細胞形狀，多數(shù)細胞核DNA著色淺淡。×400

圖4 OR組胎盤絨毛，細胞核DNA深染，合體結(jié)節(jié)(箭頭)?！?00

組別羊膜胎盤對照組OR組49.8±6.381.3±8.635.2±4.876.3±11.4

注：兩組比較，P<0.01。

3 討 論

雖然目前有多種檢測細胞凋亡的方法[4]，但是尚缺乏簡便易行的形態(tài)學檢測方法。DNA-RNA染色是對比顯示DNA和RNA分布的經(jīng)典組織化學方法。甲基綠多與DNA特異結(jié)合的活性染料，顯示藍綠色，DNA聚合程度越高著色越深；派洛寧則多選擇性的與RNA結(jié)合顯示紅色。根據(jù)凋亡細胞典型的形態(tài)特征，如染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀及凋亡小體形成等，鏡下比較容易觀察。恰恰聚合程度高的DNA是光鏡下凝聚的異染色質(zhì)，碎解的顆粒狀染色質(zhì)是異染色質(zhì)遭受損傷、破壞的結(jié)果。染色質(zhì)的凝集與斷裂是細胞凋亡過程中的一個重要變化。根據(jù)此原理對顯示羊膜細胞和胎盤滋養(yǎng)細胞的活性，并以此推斷羊膜和胎盤的功能狀態(tài)，有很好的應(yīng)用價值。胎盤自妊娠37周以后開始有老化改變并逐漸加重，胎盤老化改變主要表現(xiàn)為胎盤生長減慢甚至停止，胎盤表面、絨毛板和絨毛間隙出現(xiàn)纖維蛋白沉著和鈣化灶，絨毛上皮和血管基底膜增厚，常伴有胎盤功能減退[5-6]。本實驗結(jié)果顯示，對照組羊膜和胎盤滋養(yǎng)細胞核甲基綠染色弱陽性者為多，說明細胞功能尚可抑或活躍；而實驗組則強陽性者為多(凋亡細胞)(P<0.01)，DNA-RNA組織化學反應(yīng)強度比較(P<0.01)。細胞凋亡增加可能是胎盤提前老化的發(fā)病機制之一，34周前即已開始[7-8]。妊娠終、末期應(yīng)利用其它手段嚴密觀察胎膜、胎盤及胎兒的發(fā)育情況，以便盡早發(fā)現(xiàn)問題。

至于對照組羊膜細胞及胎盤滋養(yǎng)層細胞出現(xiàn)的一定數(shù)量的凋亡，是基因控制的正常妊娠的生理現(xiàn)象，胎盤通過絨毛滋養(yǎng)細胞及蛻膜細胞的凋亡與增殖來共同調(diào)節(jié)胎盤的發(fā)育和成熟，是妊娠過程的必然，可能與分娩的發(fā)動有關(guān)。

本實驗OR組羊膜細胞所顯示的反應(yīng)DNA-RNA反應(yīng)與胎盤絨毛滋養(yǎng)層細胞一致性，進一步說明過多的羊膜細胞凋亡對羊膜功能的影響，羊膜細胞過度凋亡參與OR的形成過程。結(jié)合羊膜和胎盤的諸多形態(tài)學變化，說明羊膜、尤其是胎盤老化，組織結(jié)構(gòu)受損，有效功能組織結(jié)構(gòu)減少，導致臍血流減少，胎盤的氣體交換及物質(zhì)運輸、合成能力降低，是造成羊水過少的病理學基礎(chǔ)。

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