劉建生

(泰安市婦幼保健院，山東 泰安 271000)

羊水細胞染色體分析是產(chǎn)前診斷的重要內(nèi)容，羊水細胞培養(yǎng)技術(shù)性高，難度大，培養(yǎng)條件高，易污染等問題，使培養(yǎng)成功率低。目前最常用的培養(yǎng)方法為原代培養(yǎng)和上清液培養(yǎng)，幾年來，我們針對某些生長不良細胞，在此基礎(chǔ)上利用傳代培養(yǎng)法對培養(yǎng)成功率進行了一些探討，并取得了比較滿意的效果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 自2005年1月-2013年4月在本院就診的符合產(chǎn)前診斷指征的孕婦3158例，孕周17～27周，年齡20～48歲。

1.2試劑與器材 羊水培養(yǎng)基為浙江博圣公司，培養(yǎng)瓶為BD公司，CO2培養(yǎng)箱為德國BINDER及美國Thermo，倒置顯微鏡為OLYMPUS IX-2。

1.3方法

1.3.1羊膜腔穿刺 B超定位后，常規(guī)無菌消毒，經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺術(shù)，先抽取約2 ml羊水棄去，再用20 ml注射器抽取20 ml羊水，分裝于兩個無菌離心管中。

1.3.2原代培養(yǎng)法 將抽取的羊水1500 r/min 離心10 min，去上清液留1 ml混勻，接種于4.5 ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，搖勻后置于5%CO2培養(yǎng)箱中，第7天觀察換液，并倒一瓶上清液作為轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，原代細胞換液后次日即可收獲[1]。如原代細胞收獲不佳，可再視細胞生長情況收獲上清液細胞。

1.3.3傳代培養(yǎng)法 在原代或上清液細胞生長不良時：①將無菌生理鹽水及無菌胰酶(0.5%)37℃水浴。②將原代或上清細胞的培養(yǎng)瓶輕搖棄去培養(yǎng)液，用無菌鹽水沖洗兩遍倒掉。③加無菌胰酶0.5 ml，搖勻置培養(yǎng)箱消化3～5分鐘，用倒置顯微鏡觀察消化情況，如消化完全，則立即加入4.5 ml培養(yǎng)基搖勻，放培養(yǎng)箱培養(yǎng)，視細胞多少，一般于第2～4天觀察換液，次日收獲。

1.3.4收獲 收獲前4 h加入20 μg/ml的秋水仙素30 μl，用胰酶(0.5%)消化3～5 min，后倒入離心管離心，用0.075 M的氯化鉀低滲10 min，用卡諾固定液欲固定5 min，固定2次，每次10 min，制成0.5 ml懸液，冰箱-20℃過夜，次日滴片，75℃烤片3 h后顯帶染色。

2 結(jié) 果

培養(yǎng)羊水細胞3158例，其中3052例樣本通過經(jīng)典培養(yǎng)和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)成功，染色體核型均能計數(shù)30個以上，并分散良好，帶型清晰。有2例標本輕度污染，但細胞生長較多，形態(tài)較好，正常收獲成功，培養(yǎng)成功率96.70%(3054/3158)。104例樣本生長不良，不能收獲到合格的染色體，故進行了傳代培養(yǎng)。其中細胞較少、生長緩慢79例，細胞老化10例，形態(tài)不佳6例，嚴重血性羊水8例，無細胞生長1例。通過對原代或上清液細胞的傳代培養(yǎng)，成功103例，成功率99.04%(103/104)，總成功率為99.97%(3083/3084)。1例標本因無羊水細胞生長培養(yǎng)失敗。通過傳代培養(yǎng)使成功率由96.70%提高到99.97%，染色體核型分析成功率為100%。細胞生長分布情況見表1。

表1 細胞生長情況及分布表

3 討 論

羊膜腔穿刺術(shù)是產(chǎn)前診斷的廣泛應用技術(shù)，但對于孕婦及胎兒存在一定的風險，可造成損傷、感染和流產(chǎn)[2]。羊水細胞培養(yǎng)成功是產(chǎn)前診斷的關(guān)鍵，如進行二次穿刺，可能會錯過最佳穿刺孕周，對孕婦的身體及心理也會造成一定傷害[3 ]。我們采用傳代培養(yǎng)法，針對某些特殊情況造成培養(yǎng)即將失敗時，能起到挽回彌補作用，使培養(yǎng)成功率得到保障。

如有以下情況，可進行細胞傳代培養(yǎng)，如：①由于羊水胎質(zhì)多、嚴重血性羊水，宮內(nèi)出血等，造成細胞較少(小于5個克隆)，生長緩慢稀疏，形態(tài)不佳，不能收獲到滿意的染色體。②細胞老化，超過最佳收獲時機。③原代細胞收獲不好，不能發(fā)出報告，上清液細胞生長不佳，不能收獲到滿意的染色體。

結(jié)合我們工作的實際情況，總結(jié)以下幾點經(jīng)驗：①因傳代細胞多少不一，要視細胞多少擇機換液，傳代后細胞明顯增多，生長較快，一般在2～4天換液，防止細胞老化，如細胞仍較少，可延長培養(yǎng)時間。②消化細胞前至少沖洗2遍培養(yǎng)瓶，以防殘留太多培養(yǎng)液影響消化效果。所用的胰酶不要大于1 ml,否則會影響細胞的再次貼壁。③消化后要視細胞多少分裝，如細胞老化，細胞及克隆數(shù)目較多，消化后可加9 ml培養(yǎng)基，搖勻后均分于2個培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。④原代細胞和上清細胞都可傳代，但傳代次數(shù)增多，可造成一定比例的假嵌合體[4]。因羊水細胞是貼壁生長，而我們采用的是培養(yǎng)瓶法，在收獲時可能出現(xiàn)染色體受到破壞，從而增加了羊水核型中出現(xiàn)嵌合體的幾率[5]。⑤傳代過程嚴格無菌操作，防止污染。⑥如因污染等原因，培養(yǎng)2周以上仍無細胞生長，則傳代培養(yǎng)意義不大，考慮第二次穿刺。⑦對污染標本，如羊水細胞生長尚可，可正常收獲，有些可以收到滿意效果。

綜上所述，羊水細胞傳代培養(yǎng)在細胞生長不良時，大大提高了羊水培養(yǎng)的成功率，對孕婦及胎兒減少了二次穿刺的創(chuàng)傷及心理壓力，對及時發(fā)放報告提供了條件，簡單易行，宜廣泛應用。

[1] 劉權(quán)章.人類染色體方法學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1992：285-290.

[2] 孫念怙.遺傳學疾病的產(chǎn)前診斷[M].第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社,1983：84.

[3] 何日尚,盧桂英,黃永華,等.抽取羊水進行產(chǎn)前診斷孕婦的心理問題分析[J].護理實踐與研究，2007,4(10):83-84.

[4] 張海燕,鄭陳光,杜娟,等.廣西地區(qū)產(chǎn)前診斷359例羊水細胞染色體異常核型分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2011,19(8):28-29.

[5] 蘇文,崔娓,潘麗,等.羊水檢查疑似染色體嵌合體的處理及妊娠結(jié)局[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志,2012,8,29(4):494-495.