張旭東

(解放軍八十八醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 泰安 271000)

胚泡植入到子宮內(nèi)膜的過程是一個受多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)、涉及一系列信號傳導(dǎo)、復(fù)雜而精細(xì)的生物學(xué)過程，植入過淺會導(dǎo)致流產(chǎn)、胎兒生長受限等病理情況的發(fā)生。絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的蛋白水解酶對細(xì)胞外基質(zhì)的降解在胚泡植入中起關(guān)鍵作用，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)最重要的一類水解酶，MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)中的明膠酶類，能介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入，影響胎盤和胎兒的發(fā)育[1-2]。胰島素樣生長因子-II(insulin-like growth factor-II，IGF-II)在合體滋養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞及羊膜絨毛層內(nèi)均有表達(dá)[3]。米非司酮為孕激素受體拮抗劑，與孕酮競爭受體而達(dá)到拮抗孕酮的作用，其與孕酮受體的親和力是孕酮的5倍。

本研究通過檢測米非司酮預(yù)處理的早孕婦女絨毛及正常早孕絨毛中IGF-Ⅱ及MMP-9的表達(dá)， 探討米非司酮片在終止早孕中的作用機制。

1 資料和方法

1.1研究對象及分組

1.1.1正常早孕組 選取2011年9月至2013年2月因計劃生育因素自愿到八十八醫(yī)院計劃生育門診人工流產(chǎn)的早孕婦女20例。標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡在20～35歲之間；(2)月經(jīng)規(guī)律，停經(jīng)6～7周，彩超證實為宮內(nèi)妊娠且見胚芽或胎心搏動；(3)妊娠前3個月及妊娠后未使用過甾體激素，本次妊娠期間無陰道流血、腹痛等先兆流產(chǎn)癥狀；(4) 無死胎、死產(chǎn)及自然流產(chǎn)史，排除子宮畸形、染色體、內(nèi)分泌及解剖結(jié)構(gòu)等方面的異常及自身免疫性疾病與生殖道感染。

1.1.2米非司酮預(yù)處理組 選取同一時間早孕婦女10例，標(biāo)準(zhǔn)同正常妊娠組，所有入選對象均自愿口服米非司酮片25 mg每日2次，3天，第4天上午行清宮術(shù)留取絨毛標(biāo)本。

1.2材料和方法

1.2.1絨毛組織 無菌采集研究對象絨毛組織，約1×1×1 cm3，生理鹽水漂洗，置于凍存管內(nèi)封存后-70℃儲存待檢，以提取組織總RNA。

1.2.2引物序列 IGF-II：上游引物，5'- ACTCGGCCAGAGCGGCG -3'，下游引物，5'-GCACCAGCATCGACTTCCCCA-3'；MMP-9上游引物5'-GGTGGACCGGATGTTCCCCG-3'，下游引物，5'-CGCGCCAGTAGAAGCGGTCC-3'；GAPDH: 上游引物，5'-A CCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCTGTTGCTGTA-3'(上海生工生物工程有限公司)。

1.2.3主要試劑及儀器 Trizol Reagent(Invitrogen公司)。Reverse Transcription System(TAKARA公司)。SYBROR Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time) (TAKARA公司)。Nanodrop2000型核酸分析儀(Thermo)，ABI9700型PCR儀(ABI)。米非司酮為北京紫竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2.4實驗方法 RT-PCR 嚴(yán)格按照說明書步驟提取總RNA。測得OD260/OD280在1.8～2.0之間。1.5% agarose gel 2～4 μl RNA上樣，電泳檢測RNA完整性。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟合成cDNA。設(shè)定以下PCR程序：95℃ 30秒，95℃ 5秒，60℃ 30～34秒共40個循環(huán)。計算△Ct值，進(jìn)而計算2-△Ct。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗，顯著性檢驗水平為0.05。

2 結(jié) 果

米非司酮預(yù)處理組絨毛中IGF-ⅡmRNA的表達(dá)水平低于對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，MMP-9 mRNA的表達(dá)水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組絨毛組織中IGF-II與MMP-9 mRNA的相對表達(dá)

3 討 論

早孕期胚泡植入到子宮內(nèi)膜的過程是非常復(fù)雜的，涉及到多個細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)機制非常精細(xì)、復(fù)雜。此過程受母體多個免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，是母體與胚胎相互調(diào)節(jié)、共同作用的結(jié)果，此期的子宮內(nèi)膜具有較好的容受性，與胚泡同步發(fā)育，出現(xiàn)一個允許胚胎植入的較為短暫的時期，稱為種植窗期。

胚泡的植入在時間和空間上均受到母體免疫系統(tǒng)的嚴(yán)格控制，時間上表現(xiàn)為滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜的過程終止于妊娠中期，空間上則表現(xiàn)為滋養(yǎng)細(xì)胞僅侵入子宮脫膜及近1/3的子宮肌層。如免疫系統(tǒng)或調(diào)節(jié)因子表達(dá)異常，絨毛的侵入就會過深或過淺，從而導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞疾病、流產(chǎn)、胎兒生長受限、子癇的病理情況，在這一過程中MMPs及MMPs與其抑制因子的相互協(xié)調(diào)平衡起著重要的作用。MMP-9屬于MMPs中的明膠酶類，主要降解Ⅳ膠原及其他ECM,如膠原Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ, 層黏連蛋白,纖維連接蛋白及玻連蛋白[4]。MMP-9是絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)的限速酶。MMP-9在絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞中呈顯著高表達(dá)[5]。

IGFs 是體內(nèi)重要的生長因子，通過自分泌、旁分泌等方式對組織細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、機體的生長發(fā)育及腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要的調(diào)節(jié)作用。IGF-II mRNA在人早孕絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)率為100%，絨毛小葉的合體滋養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞中均有IGF-II表達(dá)[6]。胚胎著床的各個環(huán)節(jié)中都有IGFs的參與調(diào)節(jié)。Irwind等發(fā)現(xiàn)IGFs可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞分泌MMPs，進(jìn)而加強滋養(yǎng)細(xì)胞向子宮脫膜的侵入。

本研究采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測6～7周正常早孕絨毛組織中及經(jīng)米非司酮預(yù)處理后的早孕絨毛組織中IGF-II mNA、MMP-9 mRNA的表達(dá)，顯示經(jīng)米非司酮預(yù)處理后早孕絨毛組織中IGF-II mRNA的表達(dá)雖低于對照組，但差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而MMP-9 mRNA的表達(dá)卻明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。MMP-9表達(dá)降低，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)能力下降，浸潤能力減弱，絨毛侵入不足，進(jìn)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞對子宮脫膜及肌層的浸潤和血管重鑄，最終導(dǎo)致流產(chǎn)。這可能是米非司酮片能用于終止早孕的一個作用機理，當(dāng)然其在終止早孕過程中的具體作用機制尚待進(jìn)一步研究證實。

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