常 歡 王 云 韓繼舉 張 慧 夏作理 高允生 趙曉民

(1.泰山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室； 2.泰山醫(yī)學(xué)院動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東 泰安 271000)

在有關(guān)小鼠血小板黏附、聚集和血液多指標(biāo)研究中常需要較多血液才能完成。小鼠麻醉后開胸直視心臟下取血，具有容易刺入心臟取血的優(yōu)點(diǎn)，可以獲取一定量的血液[1]。但抽血后期針頭容易受血凝塊堵塞，從而影響取血量。因而本實(shí)驗(yàn)建立一種小鼠心臟取血的改良方法(全身血液肝素化)，分析影響取血量的因素，以期為從小鼠心臟較多取血提供一種參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：80只SPF級(jí)昆明種小白鼠，雌雄各半，體重19～28 g，購(gòu)于山東泰邦生物制品有限公司。主要設(shè)備和藥品試劑：戊巴比妥鈉(Merck公司)，肝素鈉注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司)；0.9%氯化鈉溶液(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司)。

1.2方法 小鼠隨機(jī)分為傳統(tǒng)心臟取血組(傳統(tǒng)取血組)、改良心臟取血組(改良取血組)，n=20(雌雄各半)。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉。記錄腹腔注射藥物至深反射消失時(shí)間，作為麻醉誘導(dǎo)時(shí)間。之后迅速仰位固定小鼠，沿劍突至兩側(cè)腋窩下剪開胸腔，暴露心臟。記錄自開胸起始至結(jié)束時(shí)間，作為開胸時(shí)間。改良取血組：1 ml注射器針頭(直徑0.4 mm)由小鼠左室快速注射200 U/ml肝素生理鹽水(10 ml/kg)，停3～5 s后，2.5 ml注射器針頭(直徑0.6 mm，200 U/ml肝素生理鹽水潤(rùn)洗)直接由右室進(jìn)針抽血，直至無明顯血液取出。傳統(tǒng)取血組：只用注射器(肝素生理鹽水潤(rùn)洗)自右室進(jìn)針抽血。記錄針頭進(jìn)入右室至抽血結(jié)束時(shí)間，為取血時(shí)間。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。用Pearson或Spearman相關(guān)以及多元線性回歸法分析取血量與其他因素之間的關(guān)系。P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1改良取血法對(duì)取血量的影響 與傳統(tǒng)取血組比較，改良取血組雄鼠和雌鼠的取血量顯著增加(均P<0.001)，但體重、麻醉誘導(dǎo)時(shí)間、開胸時(shí)間、取血時(shí)間無顯著性差異。在改良取血組，雌雄鼠取血量、麻醉誘導(dǎo)時(shí)間、開胸時(shí)間和取血時(shí)間均無顯著性差異。見表1。

2.2取血量與體重、麻醉誘導(dǎo)時(shí)間、開胸時(shí)間和取血時(shí)間關(guān)系 將改良取血法中雌雄鼠作為整體，相關(guān)分析結(jié)果顯示，取血量與體重、麻醉誘導(dǎo)時(shí)間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(分別P<0.001，P<0.01)，與性別、開胸時(shí)間、取血時(shí)間無顯著相關(guān)關(guān)系。見表2。以取血量為因變量，體重和麻醉誘導(dǎo)時(shí)間為自變量，多元回歸分析結(jié)果顯示：體重和麻醉誘導(dǎo)時(shí)間均進(jìn)入回歸方程(分別P<0.01，P<0.05)，回歸方程式：y(取血量)=0.440×體重+0.046×麻醉誘導(dǎo)時(shí)間。

表1 兩種取血方法中體重、麻醉誘導(dǎo)時(shí)間、開胸時(shí)間、取血時(shí)間、取血量的比較(n = 20)

注：*P< 0.001，與傳統(tǒng)取血組同性別鼠比較。

表2 血量與體重、麻醉誘導(dǎo)時(shí)間、開胸時(shí)間和取血時(shí)間的相關(guān)系數(shù)

注：*P<0.01,**P<0.001。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用小鼠心臟取血的改良方法，比傳統(tǒng)的心臟取血方法可取得更多血液，適合于開展血小板多指標(biāo)的有關(guān)實(shí)驗(yàn)。改良心臟取血法技術(shù)要點(diǎn)為：抽血前自左室快速注射肝素(200 U/kg)，使全身血液肝素化，隨即應(yīng)用肝素化2.5 ml注射器針頭從右室抽血。

心臟取血前需開胸術(shù)，開胸為一種創(chuàng)傷，可引起血液高凝，伴有微粒和凝血酶產(chǎn)生增多[2]，若無抗凝藥物應(yīng)用，小鼠體內(nèi)會(huì)有微血栓形成而對(duì)取血量和血液成分帶來影響。此外抽血時(shí)血液接觸抽血器具內(nèi)面，會(huì)激活凝血系統(tǒng)[3]，因而若抽血器具內(nèi)無抗凝藥物使用，血液會(huì)在抽血器具內(nèi)形成凝血團(tuán)塊，不但堵塞針頭，也會(huì)改變血液成分。肝素具有體內(nèi)抗凝血[4]，故本實(shí)驗(yàn)取血的改良方法，應(yīng)用肝素左室內(nèi)注射、抽血器具肝素化處理，從而實(shí)現(xiàn)順利抽血和血液成分較少改變的效果。

本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為抽血器具以2.5 ml注射器為宜，可以避免因針頭內(nèi)徑過細(xì)增加血液通過針頭的剪切力，引起溶血[5]、凝血系統(tǒng)激活和血小板活化的弊端[6-7]；也可避免針頭內(nèi)徑較粗引起右室過多損傷，產(chǎn)生血液回流減少的不利因素。

為了保證從取血的改良方法能夠較多量取血，本實(shí)驗(yàn)觀察了影響取血量的因素，除了體重影響取血量之外，結(jié)果還表明：①應(yīng)用戊巴比妥鈉的麻醉誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)取血量有一定影響。選用戊巴比妥鈉麻醉的主要原因是，該藥對(duì)心功能抑制較小、心率降低較輕[8]，能保證左室注射對(duì)全身肝素化的效果以及較多血液回流至右心室。麻醉誘導(dǎo)時(shí)間影響取血量可能與當(dāng)麻醉誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，表明小鼠對(duì)戊巴比妥鈉較為耐受，相對(duì)出現(xiàn)心臟抑制、血管擴(kuò)張的作用較輕、較慢[9]，因而全身肝素化效果較好、回心血量較多，從而使取血量相應(yīng)增加。②取血量與開胸時(shí)間、抽血時(shí)間無顯著相關(guān)關(guān)系。開胸后，本實(shí)驗(yàn)觀察到心臟會(huì)持續(xù)搏動(dòng)5 min左右，由于開胸時(shí)間不超過35 s，抽血時(shí)間不超過130 s，均遠(yuǎn)低于心臟停止搏動(dòng)時(shí)間，因而二者對(duì)取血量影響不大。此外，實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)性別對(duì)取血量的影響，這可能與實(shí)驗(yàn)中對(duì)雌雄小鼠的處理因素一致有關(guān)。

總之，小鼠心臟取血的改良方法可以較多量地取血，體重和麻醉誘導(dǎo)時(shí)間為取血量影響因素，為從小鼠較多量取血提供了一種途徑，有利于應(yīng)用小鼠開展血小板黏附聚集和血漿多指標(biāo)觀察。局限性在于不適合于有關(guān)血?dú)獾难芯?、?dòng)物不能存活、對(duì)凝血指標(biāo)有影響等。

[1] Joslin JO. Blood collection techniques in exotic small mammals[J]. J Exot Pet Med,2009, 18(2):117-139.

[2] Park MS, Owen BA, Ballinger BA,et al.Quantification of hypercoagulable state after blunt trauma: microparticle and thrombin generation are increased relative to injury severity, while standard markers are not[J]. Surgery, 2012,151(6):831-836.

[3] Differding JA, Underwood SJ, Van PY,et al.Trauma induces a hypercoagulable state that is resistant to hypothermia as measured by thrombelastogram[J]. Am J Surg,2011, 201(5): 587-591.

[4] Muriithi EW, Belcher PR, Day SP, et al.Heparin-induced platelet dysfunction and cardiopulmonary bypass[J].Ann Thorac Surg, 2000,69(6): 1827-1832.

[5] Sharp MK, Mohammad SF. Hemolysis in needleless connectors for phlebotomy[J]. ASAIO J,2003,49(1):128-130.

[6] Miyazaki Y, Nomura S, Miyake T,et al.High shear stress can initiate both Platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles[J]. Blood, 1996, 88(9): 3456-3464.

[7] Chen YW, Chen YC, Wang JS. Absolute hypoxic exercise training enhances in vitro thrombin generation by increasing procoagulant platelet-derived microparticles under high shear stress in sedentary men[J]. Clin Sci (Lond),2013, 124(10):639-649.

[8] Janssen BJ, De Celle T, Debets JJ, et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004,287(4):H1618- 1624.

[9] 范禮理，孫麗紅，孫卓前，等.羥苯氨酮對(duì)戊巴比妥鈉致心力衰竭的治療作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1999,34(2):103-108.