程民，陳穩(wěn)，毛菊，王靜，程翠，沈國(guó)棟，卞庚，徐婷娟，徐維平，沈干，胡世蓮

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，合肥 230001；2.安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所；3.腫瘤免疫與營(yíng)養(yǎng)治療安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞基本特性及抗腫瘤效應(yīng)研究

程民1，2，3，陳穩(wěn)1，2，3，毛菊1，2，3，王靜1，程翠1，沈國(guó)棟1，2，3，卞庚1，2，3，徐婷娟1，2，3，徐維平1，2，3，沈干1，胡世蓮1，2，3

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，合肥 230001；2.安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所；3.腫瘤免疫與營(yíng)養(yǎng)治療安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

目的建立培養(yǎng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷（CIK）細(xì)胞方法，并評(píng)價(jià)其基本特點(diǎn)、體內(nèi)外抗腫瘤活性及安全性。方法使用抗CD3單克隆抗體、rhIL-2及rh IFN-γ刺激PBMC細(xì)胞，使其在體外大量擴(kuò)增，利用流式細(xì)胞術(shù)、體外殺傷實(shí)驗(yàn)及荷人卵巢癌小鼠模型檢測(cè)CIK細(xì)胞的特點(diǎn)及抗腫瘤活性；并檢測(cè)CIK細(xì)胞中外源性因子污染情況及其急性毒性作用。結(jié)果體外培養(yǎng)21 d后，CIK細(xì)胞總數(shù)可達(dá)1010以上，其主要成分為CD3＋CD8＋T細(xì)胞及CD3＋CD56＋NKT細(xì)胞，CIK細(xì)胞在體外對(duì)Ho8910、A549、K562及HepG2細(xì)胞均有較高的殺傷活性，并對(duì)荷瘤小鼠具有治療作用。同時(shí)在CIK細(xì)胞中未檢測(cè)到外源性病原體污染。結(jié)論CIK細(xì)胞在體內(nèi)外均具有較高的抗腫瘤活性且無(wú)毒性作用。

免疫療法；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞；卵巢腫瘤；疾病模型，動(dòng)物

目前，手術(shù)和放、化療已成為臨床上治療腫瘤的主要手段，并取得了一定的治療效果，但目前腫瘤的復(fù)發(fā)率和死亡率仍然較高。腫瘤細(xì)胞免疫治療因其殺瘤識(shí)別譜廣、抗癌殺傷力高、毒副作用小等特點(diǎn)，已成為第四大腫瘤治療模式。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK細(xì)胞）是由細(xì)胞因子（如IL-2、IL-1α、IFN-γ和抗CD3McAb等）在體外誘導(dǎo)人外周血或臍血單個(gè)核細(xì)胞而獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，具有抗腫瘤作用，目前已應(yīng)用于腫瘤患者的臨床治療，但不同的培養(yǎng)方法對(duì)CIK細(xì)胞抗腫瘤活性影響很大，直接關(guān)系到腫瘤患者的治療效果［1］。因此，建立規(guī)范化的培養(yǎng)方法，獲得高抗腫瘤活性的CIK細(xì)胞，并將其應(yīng)用于臨床腫瘤治療具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離、培養(yǎng)試劑 本研究中，共收集健康志愿者外周血標(biāo)本10份，50mL／份。

1.1.2 細(xì)胞株、培養(yǎng)基 K562細(xì)胞、A549細(xì)胞、HepG2細(xì)胞及vero細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），Ho8910細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI 1640、DMEM干粉培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，碳酸氫鈉（分析純）、二甲基亞砜（分析純）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，胎牛血清購(gòu)自上海依科賽生物制品有限公司，胰蛋白酶購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

圖2 培養(yǎng)不同天數(shù)后CIK細(xì)胞表面CD3、CD4、CD8及CD56分子的表達(dá)(n=10)

圖4 體外培養(yǎng)的CIK細(xì)胞對(duì)荷瘤小鼠的治療作用(*P＜0.05)

插圖3-1

1.1.3 流式細(xì)胞術(shù)分析試劑 FITC-anti-CD8、PE-anti-CD56、PE-Cy5-anti-CD3及Alexa-647-anti-CD4等單克隆抗體及各種抗體相對(duì)應(yīng)的同種型抗體均購(gòu)自BD Pharmingen公司（San Diego，USA）。Mouse IgG（11.5 mg／mL）購(gòu)自BIODESIGN公司（Saco，USA）。KH2PO4、Na2HPO4·12H2O及NaCl等分析純?cè)噭┵?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 細(xì)胞毒活性檢測(cè)試劑 Na51CrO4溶液購(gòu)自中國(guó)同位素總公司（美國(guó)PerkinElmer公司生產(chǎn)），TritonX-100購(gòu)自Sigma Chemical Co.公司。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL／6小鼠，SPF級(jí)，雌性，6～8周齡，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海斯萊科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。裸鼠（BALB／c背景），SPF級(jí)，雌性，4～5周齡，購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件為：SPF級(jí)，22°C，55%濕度，12 h白天／黑夜節(jié)奏。實(shí)驗(yàn)流程和小鼠處理過程遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)范條例。

1.1.6 外源性因子檢測(cè)試劑 改良馬丁培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、肺炎支原體肉湯培養(yǎng)基、支原體瓊脂培養(yǎng)基、支原體半流體培養(yǎng)基、精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，支原體染色檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）、單純皰疹病毒Ⅱ型核酸擴(kuò)增（PCR）熒光定量檢測(cè)試劑盒、人類免疫缺陷病毒1型核酸定量檢測(cè)試劑盒（巢式PCR-熒光法）、人巨細(xì)胞病毒核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒及丙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）購(gòu)自達(dá)安基因股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離、CIK細(xì)胞培養(yǎng) 使用無(wú)菌淋巴細(xì)胞分離液分離外周血PBMC細(xì)胞，并使用30 mL CIK細(xì)胞培養(yǎng)液（GT-T551培養(yǎng)基＋1000IU／mL IL-2＋1000IU／mL IFN-γ）重懸分離所得的PBMC細(xì)胞，置于已包被抗CD3單克隆抗體的75 cm2培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度、37℃、5.0%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，期間根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況添加CIK細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)分析 每個(gè)樣品管取PBMC細(xì)胞或培養(yǎng)不同時(shí)間的CIK細(xì)胞1×106個(gè)，使用100μL 1×PBS溶液重懸細(xì)胞成單細(xì)胞懸液；每管加入mouse IgG溶液（0.1μg／μL）2μL，室溫，封閉15～30 min；向相應(yīng)樣品管中加入適量待測(cè)分子的熒光標(biāo)記抗體或同種型抗體，4°C，避光，標(biāo)記30 min；每管加入1.0 mL 1×PBS溶液，混勻細(xì)胞，4℃，3000 r／min，5min，離心，棄上清；重復(fù)洗滌2次；使用200μL 1×PBS溶液重懸標(biāo)記后的細(xì)胞，F(xiàn)ACSCalibur儀器檢測(cè)，WinMDI2.8軟件分析所得數(shù)據(jù)。

1.2.3 CIK細(xì)胞體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)檢測(cè) 使用Ho8910細(xì)胞通過腹腔注射的方式建立裸鼠卵巢癌腹水模型［2］，將制備好的CIK細(xì)胞溶液（4.0×108／mL）以腹腔注射的方式接種至成瘤鼠（接種Ho8910細(xì)胞35 d后，32 d成瘤）腹腔內(nèi)，體積為250μL；同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，給予腹腔注射PBS溶液250μL；每周3次，連續(xù)2周；觀察小鼠腹圍、體質(zhì)量、存活率、生存時(shí)間等。

1.2.4 外源性因子檢測(cè) 參照《中國(guó)藥典》三部（2010年版）方法，檢測(cè)培養(yǎng)21 d后CIK細(xì)胞中細(xì)菌、真菌、支原體等外源性因子的污染情況，并利用PCR方法檢測(cè)病毒因子等。

1.2.5 急性毒性實(shí)驗(yàn) 按照《中國(guó)藥典》三部（2010年版）方法，檢測(cè)CIK細(xì)胞對(duì)C57BL／6小鼠的急性毒性作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)使用SPSS10.0軟件分析，用t檢驗(yàn)或方差分析比較獨(dú)立樣本之間的差異，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有顯著性，生存分析使用Kaplan-Meier方法，散點(diǎn)圖使用ORIGIN 7.5軟件繪出并分析。

2 結(jié)果

2.1 CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增方法的建立 利用顯微鏡觀察CIK細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，CIK細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)，成團(tuán)細(xì)胞較多，生長(zhǎng)狀態(tài)較好，細(xì)胞邊緣清晰，折光性好；每周細(xì)胞計(jì)數(shù)2次，按照培養(yǎng)體積計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，并以細(xì)胞總數(shù)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間作圖，結(jié)果如圖1所示，培養(yǎng)7 d后CIK細(xì)胞出現(xiàn)快速增殖，培養(yǎng)至21 d左右增殖速度減慢，處于平臺(tái)期，培養(yǎng)21 d后細(xì)胞總數(shù)超過1×1010個(gè)。

2.2 體外培養(yǎng)過程中CIK細(xì)胞的表面分子的表達(dá)情況 體外培養(yǎng)0、7、14 d及21 d后CIK細(xì)胞表面CD3、CD4、CD8與CD56分子的表達(dá)情況，如圖2所示。新分離的外周血淋巴細(xì)胞中CD3＋CD4＋的T細(xì)胞約占40%，其次為CD3＋CD8＋T細(xì)胞約為20%，CD3-CD56＋NK細(xì)胞約12%，CD3＋CD56＋NK細(xì)胞比例約4%；培養(yǎng)7 d后CD3＋CD8＋T細(xì)胞所占比例為76.8%，明顯增加（P＜0.05）；CD3＋CD56＋NK細(xì)胞比例為4.8%，亦有所增加（P＜0.05），而CD3＋CD4＋T細(xì)胞及CD3-CD56＋NK細(xì)胞比例為11.7%和4.7%，明顯降低（P＜0.05）；培養(yǎng)14～21 d后，CD3＋CD8＋T細(xì)胞及CD3＋CD56＋NKT細(xì)胞所占比例進(jìn)一步增加，分別為89.58%及25.54%。

2.3 CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外殺傷活性 體外培養(yǎng)21 d后，CIK細(xì)胞對(duì)Ho8910細(xì)胞、K562細(xì)胞、HepG2細(xì)胞及A549細(xì)胞均有不同程度的殺傷作用，對(duì)K562細(xì)胞和Ho8910細(xì)胞的殺傷力最強(qiáng)，在效／靶比為50∶1時(shí)，殺傷效率在65%～85%之間；CIK細(xì)胞對(duì)HepG2細(xì)胞和A549細(xì)胞也具有較強(qiáng)的殺傷活性，在效／靶比為50∶1時(shí)，殺傷效率在40%～60%之間（圖3）。

2.4 CIK細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng) 經(jīng)CIK細(xì)胞治療兩周后，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹圍變化較對(duì)照組慢，小鼠生存狀態(tài)較對(duì)照組好，平均生存時(shí)間對(duì)照組為59.75 d，實(shí)驗(yàn)組為80.75 d，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

2.5 CIK細(xì)胞外源性因子檢測(cè)

2.5.1 細(xì)菌、真菌檢測(cè) 取CIK細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品，培養(yǎng)14 d后，在改良馬丁培養(yǎng)基（25℃）和硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（25℃、33.5℃）中均無(wú)真菌或細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.5.2 支原體檢查 CIK細(xì)胞培養(yǎng)上清液在支原體瓊脂培養(yǎng)基、肺炎支原體肉湯培養(yǎng)基、精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基、支原體半流體培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d后，各接種管中均無(wú)支原體或其他生物生長(zhǎng)。在CIK細(xì)胞培養(yǎng)上清接種的vero細(xì)胞中亦未檢測(cè)到支原體。

2.5.3 病毒因子檢測(cè) 利用PCR方法檢測(cè)CIK細(xì)胞及其培養(yǎng)上清中病毒核酸的表達(dá)情況，結(jié)果均為陰性。

2.6 急性毒性檢測(cè) 接種CIK細(xì)胞7 d后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠均為未發(fā)生毒性反應(yīng)、過敏反應(yīng)、局部刺激反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠體質(zhì)量增加平穩(wěn)，小鼠體質(zhì)量及體質(zhì)量增加量?jī)山M之間均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

CIK細(xì)胞是由細(xì)胞因子在體外誘導(dǎo)人外周血或臍血單個(gè)核細(xì)胞而獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，主要效應(yīng)細(xì)胞是CTL細(xì)胞及NK細(xì)胞，目前已應(yīng)用于腫瘤患者的臨床治療［3］，但不同的培養(yǎng)方法對(duì)CIK細(xì)胞抗腫瘤活性及安全性影響很大，直接關(guān)系到腫瘤患者的治療效果［1］。因此，建立規(guī)范化的體外擴(kuò)增方法，獲得高抗腫瘤活性的CIK細(xì)胞，并將其應(yīng)用于臨床腫瘤治療具有重要意義。

在本研究中，我們建立和完善了體外擴(kuò)增CIK細(xì)胞的方法，培養(yǎng)21 d后CIK細(xì)胞的總數(shù)可達(dá)1010以上，可以滿足腫瘤患者臨床輸注的需要。新分離的外周血淋巴細(xì)胞中CD3＋CD4＋的T細(xì)胞所占比例較高，達(dá)40%，其次為CD3＋CD8＋T細(xì)胞，為20%；CD3-CD56＋NK細(xì)胞占12%，CD3＋CD56＋NK細(xì)胞比例最低，約為4%；培養(yǎng)7 d后，CD3＋CD8＋T細(xì)胞所占比例明顯增加（P＜0.05），CD3＋CD56＋NK細(xì)胞比例亦有增加（P＜0.05），而CD3＋CD4＋T細(xì)胞及CD3-CD56＋NK細(xì)胞明顯降低（P＜0.05）；培養(yǎng)14～21 d后，CIK細(xì)胞中主要效應(yīng)細(xì)胞CD3＋CD8＋的CTL細(xì)胞及CD3＋CD56＋NK細(xì)胞所占比例分別為89.58%及25.54%。利用51Cr釋放實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)培養(yǎng)21 d后的CIK細(xì)胞對(duì)Ho8910細(xì)胞、K562細(xì)胞、HepG2細(xì)胞及A549細(xì)胞的殺傷活性；結(jié)果表明，CIK細(xì)胞對(duì)上述腫瘤細(xì)胞均有不同程度的殺傷活性，特別是對(duì)Ho8910細(xì)胞的殺傷活性最強(qiáng)，在效／靶比為50∶1時(shí)，殺傷效率約為85%；為進(jìn)一步進(jìn)行患者體內(nèi)抗腫瘤治療奠定了基礎(chǔ)。

卵巢癌的死亡率在婦科惡性腫瘤中占第一位［4］。細(xì)胞免疫治療方法作為傳統(tǒng)治療方法（手術(shù)和放化療）的補(bǔ)充，將有助于卵巢癌患者病情控制和生存質(zhì)量的提高。目前已有多種細(xì)胞治療的方法用于卵巢癌過繼轉(zhuǎn)輸治療，但由于體外擴(kuò)增細(xì)胞技術(shù)上不足，限制了臨床上的應(yīng)用［5-7］。本研究利用規(guī)?；囵B(yǎng)的CIK細(xì)胞對(duì)人卵巢癌（Ho8910細(xì)胞）裸鼠腹水瘤模型進(jìn)行治療，評(píng)價(jià)CIK細(xì)胞對(duì)卵巢癌的治療作用；在小鼠成瘤后并有明顯的腹水形成時(shí)（接種后35 d），給予CIK細(xì)胞進(jìn)行免疫治療，效果較為明顯，表現(xiàn)為小鼠體內(nèi)腫瘤進(jìn)展速度減慢，生存質(zhì)量提高；最終對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠均死亡，死亡率未降低，但平均存活時(shí)間延長(zhǎng)（圖4）。本研究對(duì)小鼠進(jìn)行多次腹腔注射CIK細(xì)胞，對(duì)卵巢癌進(jìn)行細(xì)胞治療，效果較為理想，并且未出現(xiàn)不良反應(yīng)。在腹腔內(nèi)，CIK細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有直接的細(xì)胞毒活性，相對(duì)于靜脈注射，腹腔注射更方便，更安全。同時(shí)，本研究中所擴(kuò)增的CIK細(xì)胞進(jìn)行了外源性因子檢測(cè)及急性毒性實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)21 d的CIK細(xì)胞無(wú)細(xì)菌、真菌、支原體及病毒因子等的污染，對(duì)受試小鼠亦無(wú)急性毒性作用。

綜上所述，本研究建立了一種規(guī)范化的CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增方法，培養(yǎng)21 d后，CIK細(xì)胞的主要成分為CTL細(xì)胞和NKT細(xì)胞，且數(shù)量、質(zhì)量均可達(dá)到臨床治療的需要；CIK細(xì)胞對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷活性，并具有較好的體內(nèi)抗癌作用，不存在外源性因子的污染及急性毒性反應(yīng)等，具有較好的臨床應(yīng)用前景。

（本文圖1～4見插圖3-1）

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The study on the basic characteristics and the anti-tumor effects of CIK cells

CHENGMin*，CHENWen，MAO Ju，WANG Jing，CHENG Cui，SHEN Guodong，BIAN Geng，XU Tingjuan，XU Weiping，SHEN Gan，HU Shilian
（*Anhui Province Hospital Affiliated Anhui Medical University，Hefei230001，China）

HU Shilian，Email：hushilian＠126.com

ObjectiveTo establish the methods of cytokine-induced killer（CIK）cells and evaluate the characteristics，anti-tumor activity in vitro and in vivo and the safety.MethodsAnti-CD3 mAb，recombinant human interleukin2（rhIL-2）and recombinanthuman interferon-γ（rhIFN-γ）were used to induce the peripheralbloodmononuclear cells（PBMCs）proliferation abundantly in vitro.Flow cytometry assay（FACS），in vitro cytotoxicity assay and tumormousemodel xenografted with Ho-8910（human ovarian cancer cell line）were used to detect the characteristics and the anti-tumor activityof CIK cells.Additionally，the contamination of exogenous agents and the acute toxicity effectof CIK cellswere also determined.ResultsAfter21 days in vitro culture，the total number of CIK cells weremore than 1010，among which there weremainly CD3＋CD8＋T cells and CD3＋CD56＋NKT cells.CIK cells displayed high cytotoxicity against Ho8910，A549，K562 and HepG2 cells in vitro，and they also showed therapeutic effects in tumor xenograftedmice.Additionally，no acute toxicity was observed in CIK cells-treatedmice，and therewas also no contamination of bacteria，fungus，mycoplasma and virus in CIK cells.ConclusionCIK cells have high antitumor activity without any toxic side effects.

Immunotherapy；Cell culture techniques；Cytokine-induced killer cells；Ovarian neoplasms；Disease Models，Animal

R730.51

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.03.019

2014-02-20）

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81071808）；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1408085MH156）；安徽省醫(yī)學(xué)研究項(xiàng)目（13zc025）；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（12010402126）；安徽省腫瘤免疫營(yíng)養(yǎng)診療產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助

程民，助理研究員，Email：chengmin＠ustc.edu.cn

胡世蓮，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，Email：hushilian＠126.com