王世兵，孟樹林，武 虎，馬步云

（浙江理工大學，a.生命科學學院科研實驗中心；b.新元醫(yī)學與生物技術研究所，杭州310018）

雙基因溶瘤腺病毒聯(lián)合5-FU抑制肺癌細胞增殖的研究

王世兵a，孟樹林b，武 虎b，馬步云b

（浙江理工大學，a.生命科學學院科研實驗中心；b.新元醫(yī)學與生物技術研究所，杭州310018）

研究攜帶TRAIL和Smac的雙基因溶瘤腺病毒（ZD55-TRAIL-IFTD-Smac）聯(lián)合化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）對肺癌細胞的體外殺傷作用。通過MTT法檢測細胞抑制率，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Western Blot檢測殺傷性基因表達與凋亡相關蛋白表達。結果顯示ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU聯(lián)合應用能有效地抑制肺癌細胞的增殖，并通過激活Caspase通路誘導肺癌細胞產生凋亡，表明，5-FU能夠顯著增強攜帶TRAIL和Smac的雙基因溶瘤腺病毒對肺癌細胞的殺傷作用，為肺癌的臨床應用提供了參考。

ZD55-TRAIL-IFTD-Smac；5-FU；肺癌；凋亡

0 引 言

肺癌是最為常見的惡性腫瘤之一，尤其在城市，其高發(fā)病率與死亡率都居于惡性腫瘤之首，嚴重威脅著人類的健康。目前，肺癌治療仍然以傳統(tǒng)的手術放療、化療為主，然而其治療后5年生存率僅為15%，隨著人類對癌癥發(fā)病機制的深入研究，人們把關注的目光投向了生物治療［1-2］。中國科學院劉新垣院士在提出癌癥靶向基因-病毒治療的策略［3］（cancer targeting gene-virotherapy，CTGVT）后又提出了癌癥的靶向雙基因治療策略［4-5］（Cancer targeting dual gene-virotherapy），其基本理念是利用腫瘤細胞與正常細胞在基因表達譜上的差異，人為改造病毒，使病毒能特異性地在腫瘤細胞中復制與增殖，最終裂解細胞，而在正常細胞中幾乎不復制，對正常細胞安全。同時以這種腫瘤特異性的病毒為載體，將外源抑癌基因克隆到病毒基因組中，隨著病毒不斷擴增，使得抗癌基因得到高表達，病毒與抑癌基因兩者協(xié)同作用達到抗腫瘤的作用。

以ZD55-gene系統(tǒng)構建的溶瘤腺病毒具有僅特異地在腫瘤細胞內復制增殖，從而殺死癌細胞，而不影響正常細胞的特性。雙基因溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IFTD-Smac治療肝癌移植瘤的研究顯示，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac能在體外、體內抑制肝癌細胞的增殖［6］，但治療肺癌的研究未見報道。5-FU是一種抗腫瘤的化療藥物，抑制脫氧胸苷酸合成酶，阻止脫氧尿苷酸（d UMP）甲基化轉變?yōu)槊撗跣剀账幔╠ TMP），從而影響DNA的合成。盡管5-FU單獨治療并不能顯著改善患者的生存率，然而通過與溶瘤腺病毒聯(lián)合治療，5-FU通常有不錯的協(xié)同治療效果，研究表明ZD55-MnSOD聯(lián)合5-FU具有協(xié)同作用，可以顯著提高對結腸癌的療效［7］，5-FU與Addel-F1B55聯(lián)合治療可以減少單獨治療時的用藥量，治療效果卻要高于單獨用藥的療效［8］。Adsh TS與5-FU聯(lián)合治療有效地抑制了DLD-1/ 5FU，KM12C/5FU和N M GC-3/5FU三種耐藥癌細胞的增殖［9］。5-FU與h TRAIL聯(lián)合治療能顯著提高h TRAIL誘導多種癌細胞的凋亡［10-12］，而且這種協(xié)同作用在一些多藥耐藥細胞系以及TRAIL耐藥癌細胞系都有所發(fā)現(xiàn)［13-14］。因此，基因治療和化療聯(lián)合治療可以作為癌癥治療的新思路。

TRAIL基因屬于TNF超家族，由于其具有特異性地誘導多種腫瘤細胞凋亡且不影響正常細胞的特性而備受青睞。TRAIL基因主要通過結合于腫瘤細胞表面的死亡受體，促使依賴于線粒體信號途徑的細胞凋亡［15-16］。盡管TRAIL可通過與死亡受體DR4或DR5特異地結合并誘導癌細胞凋亡［17-18］，然而許多癌細胞對TRAIL誘導的凋亡高度鈍化［19-21］。Smac基因可以通過Cytochrome c/ Apaf-1/Caspase-9信號通路，激活Caspase級聯(lián)反應，主要通過抑制IAPs，促進細胞凋亡［22］。Smac過表達可以有效增加細胞對凋亡刺激的敏感性［23-24］；因此，筆者聯(lián)合雙基因溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU體外作用于肺癌細胞，其效果遠遠強于基因治療或化療分別單獨作用肺癌細胞時的效果。本研究主要探討了ZD55-TRAILIFTD-Smac聯(lián)合5-FU對于肺癌細胞增殖的抑制以及其誘導細胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌細胞株H1299、NCI-H460和A549由本實驗室保存，細胞均培養(yǎng)于體積分數(shù)為5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中，細胞培養(yǎng)液為含10%FBS的DMFM（Dulbeccos modified Fagle medium），DMFM購自杭州吉諾生物技術有限公司，F(xiàn)BS購自GIBCO公司；MTT染料購自Sigma公司；Caspase-3，Caspase-8抗體購自Cell Signaling Technology公司；TRAIL、Smac、F1A、poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）和GAPDH抗體均購自Santa Cruz公司；BCA法蛋白定量試劑盒購自Thermo Fisher公司；IRDye?680Donkey Anti-Goat IgG，IRDye? 680 Donkey Anti-Mouse IgG，IRDye?800 Donkey Anti-Rabbit IgG均購自LI-COR公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT染色檢測細胞增殖

取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞，收集細胞，用含5%FBS的DMFM重懸細胞，計數(shù)，將細胞稀釋至需要的密度，以每孔100μL接種于96孔板中，使細胞密度為1×104個/孔。5%CO2、37℃培養(yǎng)12 h分別在相應孔中加病毒ZD55-TRAIL-IFTDSmac，5-FU，病毒ZD55-TRAIL-IFTD-Smac+5-FU，實驗組與對照組分別設5個復孔。孵育72 h后，每孔加入20μL MTT溶液（5 g/L，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內配養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔的OD490 nm吸光值，同時設置調零孔。細胞生存率=（處理組吸光值-調零孔吸光值）/（對照孔吸光值-調零孔吸光值）×100%。

1.2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率

在6孔板中以每孔5×105個細胞接種細胞，37℃、5%CO2貼壁培養(yǎng)12 h后，在處理組細胞中分別加入0.8μg/mL 5-FU，4MOI病毒ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，0.8μg/mL 5-FU+4MOI病毒ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，對照組中加入相同體積的PBS，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)基，按細胞傳代方法收集細胞，參照AnnexinⅤ/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒操作說明，用預冷的PBS洗滌收集的細胞2遍，然后用100μL的1×結合緩沖液重懸細胞，每孔中分別加入5μL的1×Annexin-Ⅴ和5μL的1×PI，室溫下避光搖床上低速孵育15 min后，加入400μL 1×結合緩沖液，流式細胞儀分析。

1.2.3 Western blot檢測目的基因及細胞凋亡信號通路中關鍵蛋白的表達

將5×105個細胞接種到6孔板中，37℃、5% CO2貼壁培養(yǎng)12 h后，在處理組細胞中分別加入0.8μg/mL 5-FU，4MOI病毒ZD55-TRAIL-IFTDSmac，0.8μg/mL 5-FU+4MOI病毒ZD55-TRAILIFTD-Smac，設立加入等量PBS為對照組，37℃、5% CO2，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后按Western blot操作裂解細胞收集上清總蛋白。按Thermo Fisher公司BCA蛋白定量試劑盒操作說明定量收集的蛋白濃度。將定量蛋白以每孔加入10μg總蛋白樣加入SDSPAGF電泳，電泳結束后按半干轉膜法轉膜（NC膜），5%的脫脂奶粉中封閉2 h，一抗孵育，按抗體說明書上的最佳稀釋濃度稀釋加一抗（1∶1 000稀釋），室溫下于搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入稀釋好的熒光二抗（1∶15 000稀釋），室溫下?lián)u床孵育45～60 min，TBST洗膜3次，每次10 min，用LI-COR掃膜儀掃膜，紅外激光成像系統(tǒng)對待測蛋白進行分析。

1.2.4 統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS統(tǒng)計軟件進行方差分析，全部結果用（均值±標準差）表示。

2 結 果

2.1 MTT分析檢測5-FU與病毒聯(lián)用對肺癌細胞的抑制作用

本實驗分別利用目的病毒ZD55-TRAILIFTD-Smac，5-FU，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU聯(lián)用處理H1299、NCI-H460和A549肺癌細胞。細胞處理分別設ZD55-TRAIL-IFTD-Smac 1、2、4、8 MOI的4個梯度，設5-FU 0.2、0.4、0.8、1.6 μg/mL的4個梯度。如圖1所示，ZD55-TRAILIFTD-Smac單獨處理H1299，NCI-H460和A549肺癌細胞時，其抑制率分別為1.4%～37.1%，5.4%～47.9%，6.9%～47.9%。5-FU單獨處理H1299，NCI-H460和A549肺癌細胞時，其抑制率分別為6.6%～46.8%，5.1%～44.5%，3.6%～44.9%。ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU聯(lián)用其抑制率分別達到17.9%～74.8%，19.7%～71.3%，17.1%～75.5%。從圖2上可以看出，二者的聯(lián)用有效地抑制了肺癌細胞的增殖，聯(lián)用的作用效果不是簡單地二者單獨作用效果的疊加，二者具有一定的協(xié)同作用。

圖1 MTT法檢測細胞存活率

圖2 流式細胞術檢測細胞凋亡

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率

ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，5-FU，ZD55-TRAILIFTD-Smac與5-FU聯(lián)用分別處理H1299，NCIH460肺癌細胞，處理劑量分別為4MOI，0.8μg/ mL，4MOI+0.8μg/mL，設立加等量PBS的對照組，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞，AnnexinⅤ/PI雙染后流式細胞儀檢測細胞凋亡。如圖2在Q4區(qū)AnnexinⅤ高陽性，PI低陽性的區(qū)域為早期凋亡細胞。實驗結果表明對照組，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，5-FU，ZD55-TRAIL-IFTDSmac與5-FU聯(lián)用分別處理H1299，NCI-H460細胞，H1299細胞早期凋亡率依次為2.2%、2.7%、9.5%、22.2%；NCI-H460細胞早期凋亡率依次為2.9%、2.8%、6.4%、27.1%。說明ZD55-TRAILIFTD-Smac與5-FU聯(lián)用起到了很好地誘導肺癌細胞凋亡的作用。

2.3 Western blot檢測抑癌基因及凋亡相關蛋白的表達變化

ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，5-FU，ZD55-TRAILIFTD-Smac與5-FU聯(lián)用處理NCI-H460細胞，劑量為4MOI+0.8μg/m L，設立加等量PBS的對照組，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，Western blot檢測目的基因TRAIL、Smac的表達及凋亡相關蛋白的變化。結果如圖3，在ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU聯(lián)用處理A549細胞中，TRAIL和Smac都有很高的表達。在未處理組，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，5-FU，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU聯(lián)用處理組中凋亡相關蛋白caspase-8的前體及激活的Caspase-8表達量都有顯著升高。同時我們檢測到相應組細胞中Caspase-3及其活化形式呈現(xiàn)顯著變化，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU聯(lián)用處理組細胞Caspase-3活化的增強，繼而剪切凋亡底物PARP相應增加，圖4進一步有力地說明了ZD55-TRAIL-IFTD-Smac與5-FU聯(lián)用可以有效地誘導肺癌細胞凋亡。

圖3 Western blot檢測目的基因的表達

圖4 Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達

3 討 論

筆者成功地進行了溶瘤腺病毒ZD55-TRAILIFTD-Smac聯(lián)合5-FU抗癌藥物抑制肺癌細胞增殖和誘導其凋亡的體外研究。MTT實驗結果顯示，ZD55-TRAIL-IFTD-Smac聯(lián)合5-FU在處理劑量為8MOI+1.6μg/mL時效果最為明顯，其對H1299、NCI-H460和A549細胞的抑制率分別達到了74.8%、71.3%、75.5%，表明二者聯(lián)合對細胞的抑制效果明顯強于ZD55-TRAIL-IFTD-Smac和5-FU分別單獨對細胞的抑制作用。流式細胞術用來檢測ZD55-TRAIL-IFTD-Smac聯(lián)合5-FU誘導細胞凋亡的情況，實驗結果表明二者聯(lián)合處理細胞時強有力地誘導了肺癌細胞的凋亡，其在處理H1299和NCI-H460兩種癌細胞系時都有很好地體現(xiàn)，二者在處理劑量為4MOI+0.8μg/m L，時間為48 h時，誘導H1299，NCI-H460細胞凋亡率分別達到了22.2%、27.1%。有研究表明ZD55-Smac與5-FU聯(lián)用能起到強有力的協(xié)同效果［22］，這一點我們的實驗結果與前人的實驗結果相符。Western blot實驗結果表明，用連接子IFTD連接的TRAIL和Smac兩段抑癌基因得到了很好地表達，而且其在細胞中能被正確的切割，同時起到了協(xié)同抑制肺癌細胞的作用。ZD55-TRAIL-IFTD-Smac聯(lián)合5-FU有效地刺激了胞內凋亡相關蛋白Caspase-3、Caspase-8和PARP的表達與激活，最終使肺癌細胞凋亡［23］。

如何提高溶瘤腺病毒的靶向性及安全性是溶瘤腺病毒治療癌癥走向臨床首要解決的問題。目前主要通過以下幾點對溶瘤腺病毒進行改造［25-26］：a）在溶瘤腺病毒的纖維蛋白結節(jié)上插入外源多肽，使得溶瘤腺病毒能特異的靶向某一類高表達特異抗原決定簇的癌細胞；b）通過嵌合修飾使溶瘤腺病毒能特異靶向于癌細胞表面的多個靶點；c）通過融合表達融合蛋白在一些缺少腺病毒結合受體（CAR）的癌細胞與溶瘤腺病毒之間架起橋梁，使一些難于被溶瘤腺病毒侵染的癌癥得到治療；d）利用癌癥組織特異性啟動子控制溶瘤腺病毒復制所需早期基因，使得溶瘤腺病毒僅在表達特異蛋白的癌細胞里大量復制、增殖，而對正常細胞無影響。

伴隨著分子生物學，細胞生物學，免疫學，生物信息學的發(fā)展，可以篩選更為有效地目的基因作為溶瘤腺病毒攻克癌癥的利器。一些植物凝集素，海洋肽內毒素，以及中草藥中有用的抗癌成分可裝載在溶瘤腺病毒上進行表達，使溶瘤腺病毒成為惡性腫瘤基因治療的有效載體。

［1］Jemal A，Bray F，Center M M，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

［2］Wagstaff A J，Keam SJ，McCormack P L.Bevacizumab plus platinum-based chemotherapy：in advanced nonsmall cell lung cancer［J］.Bio Drugs.2009，23（3）：187-196.

［3］Ranieri G，Gasparini G.Angiogenesis and angiogenesis inhibitors：a new potential anticancer therapeutic strategy［J］.Current Drug Targets Immune，F(xiàn)ndocrine and Metabolic Disorders，2001，1（3）：241-253.

［4］Zhang Z，Huang Y，Newman K，et al.Reexpression of human somatostatin receptor gene 2 gene mediated by oncolytic adenovirus increases antitumor activity of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand against pancreatic cancer［J］.Clinical Cancer Research：an official journal of the American Association for Cancer Research，2009，15（16）：5154-5160.

［5］Zhang Y，Gu J，Zhao L，et al.Complete elimination of colorectal tumor xenograft by combined manganese superoxide dismutase with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand gene virotherapy［J］.Cancer Research，2006，66（8）：4291-4298.

［6］Wang S B，Tan Y，Lei W，et al.Complete eradication of xenograft hepatoma by oncolytic adenovirus ZD55 harboring TRAIL-IFTD-Smac gene with broad antitumor effect［J］.Human Gene Therapy，2012，23（9）：992-1002.

［7］Zhang Y，Qin X，Zhang Y，et al.Combination of ZD55-MnSOD therapy with 5-FU enhances antitumor efficacy in colorectal cancer［J］.Journal of Cancer Research and Clinical Oncology，2008，134（2）：219-26.

［8］Ma G，Kawamura K，Li Q，et al.Combinatory cytotoxic effects produced by F1B-55kDa-deleted adenoviruses and chemotherapeutic agents are dependent on the agents in esophageal carcinoma［J］.Cancer Gene Therapy，2010，17（11）：803-813.

［9］Kadota K，Huang C L，Liu D，et al.Combined therapy with a thymidylate synthase-inhibiting vector and S-1 has effective antitumor activity against 5-FU-resistant tumors［J］.International Journal of Oncology.2011，38（2）：355-63.

［10］Keane M M，F(xiàn)ttenberg S A，Nau M M，et al.Chemotherapy augments TRAIL-induced apoptosis in breast cell lines［J］.Cancer research，1999，59（3）：734-741.

［11］Ashkenazi A，Pai R C，F(xiàn)ong S，et al.Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand［J］. The Journal of Clinical Investigation，1999，104（2）：155-162.

［12］Mizutani Y，Nakanishi H，Yoshida O，et al.Potentiation of the sensitivity of renal cell carcinoma cells to TRAIL-mediated apoptosis by subtoxic concentrations of 5-fluorouracil［J］.Furopean Journal of Cancer，2002，38（1）：167-176.

［13］Bonavida B，Ng C P，Jazirehi A，et al.Selectivity of TRAIL-mediated apoptosis of cancer cells and synergy with drugs：the trail to non-toxic cancer therapeutics（review）［J］.International Journal of Oncology，1999，15（4）：793-802.

［14］Nagane M，Huang H J，Cavenee W K.The potential of TRAIL for cancer chemotherapy［J］.Apoptosis：an International Journal on Programmed Cell Death，2001，6（3）：191-197.

［15］Walczak H，Miller R F，Ariail K，et al.Tumoricidal activity of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in vivo［J］.Nature Medicine，1999，5（2）：157-163.

［16］Muzio M，Chinnaiyan A M，Kischkel F C，et al. FLICF，a novel FADD-homologous ICF/CFD-3-like protease，is recruited to the CD95（Fas/APO-1）death-inducing signaling complex［J］.Cell，1996，85（6）：817-827.

［17］Pan G，O'Rourke K，Chinnaiyan A M，et al.The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL［J］.Science，1997，276（5309）：111-113.

［18］Wu G S，Burns T F，McDonald 3rd F，et al.KILLFR/DR5 is a DNA damage-inducible p53-regulated death receptor gene［J］.Nature Genetics，1997，17（2）：141.

［19］Kim K，F(xiàn)isher M J，Xu SQ，et al.Molecular determinants of response to TRAIL in killing of normal and cancer cells［J］.Clinical Cancer Research，2000，6（2）：335-346.

［20］Zhang X D，F(xiàn)ranco A，Myers K，et al.Relation of TNF-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）receptor and FLICF-inhibitory protein expression to TRAIL-induced apoptosis of melanoma［J］.Cancer Research，1999，59（11）：2747-2753.

［21］Kim Y S，Schwabe R F，Qian T，et al.TRAIL-mediated apoptosis requires NF-kappaB inhibition and the mitochondrial permeability transition in human hepatoma cells［J］.Hepatology（Baltimore，Md），2002，36（6）：1498-1508.

［22］Qiu S，Ruan H，Pei Z，et al.Combination of Targe-ting Gene-Viro Therapy with 5-FU enhances antitumor efficacy in malignant colorectal carcinoma［J］.Journal of Interferon&Cytokine Research：the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research.2004，24（4）：219-230.

［23］Shi Y.Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis［J］.Molecular Cell，2002，9（3）：459-470.

［24］Pan Q W，Zhong S Y，Liu BS，et al.Fnhanced sensitivity of hepatocellular carcinoma cells to chemotherapy with a Smac-armed oncolytic adenovirus［J］.Acta Pharmacologica Sinica.2007，28（12）：1996-2004.

［25］V?h?-Koskela M J，Heikkil?J F，Hinkkanen A F. Oncolytic viruses in cancer therapy［J］.Cancer Letters，2007，254（2）：178-216.

［26］Russell SJ，Peng K W，Bell J C.Oncolytic virotherapy［J］.Nature Biotechnology，2012，30（7）：658-670.

WANG Shi-bing1，2，MENGShu-Lin1，WU Hu1，MA Bu-yun1

（a.Scientific Research Fxperiment Center，College of Life Science；b.Xinyuan Institute of Medicine and Biotechnology，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

Study on Inhibition of Lung Cancer CeII ProIiferation by Combination of DuaI-Gene OncoIytic Adenovirus with 5-FU

The study explores the in-vitro lethal effects of dual-gene oncolytic adenovirus（ZD55-TRAIL-IFTD-Smac）with TRAIL and Smac in combination of 5-FU on lung cancer cells.Cell inhibition ratio，apoptosis rate，destruction gene expression&apoptosis-related protein expression were detected by MTT，flow cytometry and Western Blot respectively.The results show that combined application of ZD55-TRAIL-IFTD-Smac and 5-FU can effectively inhibit the proliferation of lung cancer cells and induce apoptosis of lung cancer cells through activating Caspase passage.This indicates that 5-FU can significantly enhance lethal effects of dual-gene oncolytic adenovirus with TRAIL and Smac on lung cancer cells.This provides reference for clinical application of lung cancer.

ZD55-TRAIL-IFTD-Smac；5-FU；lung cancer；apoptosis

Q789

A

（責任編輯：許惠兒）

1673-3851（2014）04-0445-06

2013-10-21

國家自然科學基金（51272236，51002139）；浙江省自然科學基金（LY13H080005）；浙江省公益性技術應用研究計劃項目（2014C37101）

王世兵（1986-），男，安徽宣城人，助理實驗師，研究方向為惡性腫瘤的生物治療。