耿新偉，孫亦靈，張柏超，蔣 磊，陳 瑋，趙輔昆

（浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州310018）

響應(yīng)面法優(yōu)化重組畢赤酵母表達(dá)纖維素酶EG27的研究

耿新偉，孫亦靈，張柏超，蔣 磊，陳 瑋，趙輔昆

（浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州310018）

為優(yōu)化重組畢赤酵母表達(dá)動(dòng)物內(nèi)源性纖維素酶FG27的培養(yǎng)基條件，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以培養(yǎng)基中酵母粉、蛋白胨、葡萄糖的含量為自變量，F(xiàn)G27的酶活為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)的方法，研究各自變量及其交互作用對(duì)畢赤酵母產(chǎn)FG27收率的影響。利用Design-Fxpert軟件和響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法對(duì)畢赤酵母產(chǎn)動(dòng)物內(nèi)源性纖維素酶FG27的培養(yǎng)基條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳的培養(yǎng)基條件。在該培養(yǎng)條件下，獲得最高產(chǎn)酶量為354 U/L。

纖維素酶；FG27；畢赤酵母；響應(yīng)面

0 引 言

工業(yè)化的快速發(fā)展使得化石燃料被大量消耗，能源危機(jī)日趨嚴(yán)重，因此，開發(fā)新能源是人類可持續(xù)性發(fā)展所面臨的重要問題。纖維素是自然界中含量最豐富的可再生資源之一［1］，全世界植物每年通過光合作用產(chǎn)生超過1013t纖維素物質(zhì)［2-5］。這些多糖類物質(zhì)可為人類提供巨大的能量來源。然而，這些材料需轉(zhuǎn)化成葡萄糖、木糖等單糖物質(zhì)才能被有效利用。通過酸水解、堿水解、酶水解等一系列手段可降解纖維素形成簡(jiǎn)單糖進(jìn)而通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇等能源物質(zhì)［5］，其中酶法水解以其高效性與環(huán)保性是最具有應(yīng)用前景的處理方法。但是纖維素酶較高的生產(chǎn)成本制約這一途徑的有效開展［6-7］，因此開發(fā)高比活的纖維素酶和提高纖維素酶的產(chǎn)量是解決這一問題的關(guān)鍵之一。

纖維素酶是一種復(fù)合酶系，包含了葡聚糖內(nèi)切酶（endo-β-1，4-glucanase，endoglucanase，F(xiàn)G，F(xiàn)C 3.2.1.4，也被稱之為纖維素內(nèi)切酶），葡聚糖外切酶（exo-β-1，4-glucanase，exocellulase，exoglucanase，cellobiohydrolase，CBH，F(xiàn)C3.2.9.11，也被稱之為纖維素外切酶）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，F(xiàn)C 3.2.1.21）［8］。本實(shí)驗(yàn)室從福壽螺的胃液中分離到一種動(dòng)物內(nèi)源性的纖維素酶FG27，該酶具有內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性。其最適p H值為4.5～5.0之間，并且在p H 3.0～11.0的范圍內(nèi)有很好的穩(wěn)定性［9-11］。此外，該酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，并且有極高的熱穩(wěn)定性。以上特性都預(yù)示著纖維素酶FG27可應(yīng)用于食品、飼料、燃料乙醇生產(chǎn)等領(lǐng)域。

響應(yīng)面分析（response surface analysis，簡(jiǎn)稱RSA）指利用數(shù)學(xué)原理設(shè)計(jì)若干具有代表性的實(shí)驗(yàn)，并通過這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，采用多元二次回歸方程來擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，然后通過對(duì)擬合的回歸方程進(jìn)行分析來尋找各個(gè)因素的最優(yōu)組合。Box-Behnken設(shè)計(jì)是一種常用的響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，在該設(shè)計(jì)中，每個(gè)因素取3個(gè)水平，分別用（-1，0，1）進(jìn)行編碼，隨后按照設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并擬合出各組實(shí)驗(yàn)值與各個(gè)因素間所關(guān)聯(lián)的響應(yīng)曲面。響應(yīng)面分析法已成為一種解決實(shí)踐中多變量問題的優(yōu)化方法而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及生物領(lǐng)域［12-15］。

本文以前期構(gòu)建的表達(dá)福壽螺內(nèi)源性纖維素酶FG27的重組畢赤酵母為對(duì)象，通過響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)初步探索了重組畢赤酵母表達(dá)FG27的最佳培養(yǎng)條件，為大規(guī)模表達(dá)FG27提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

分泌表達(dá)福壽螺纖維素酶FG27的重組畢赤酵母pGAPZaA-FG27/SMD1168由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2 試劑

酵母膏、蛋白胨購(gòu)自Sigma公司；Zeocin購(gòu)自Invitrogen公司；葡萄糖、氫氧化鈉、酒石酸鈉、3′5-二硝基水楊酸、亞硫酸氫鈉、山梨醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、Zeocin 25μg/mL。

1.1.3 儀器

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；752型分光光度計(jì)（上海第三儀器分析廠）；DHZ-D搖床（太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)

通過平板劃線法將重組酵母接種至YPD固體培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)24 h，挑取單克隆接種至3 mL YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，接種至含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中，搖床250 r/min，30℃，培養(yǎng)48 h。

1.2.2 FG27酶活的測(cè)定

20μL酶液加入180μL 1%（w/v）CMC（溶于100 mM p H4.8醋酸鈉緩沖液中）底物中，50℃水浴反應(yīng)10 min，加入0.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，立即置入冷水浴冷卻，加入0.5 mL雙蒸水，混勻后讀取520 nm處吸收光值，以滅活的酶液經(jīng)相同測(cè)活方法作為空白對(duì)照組。FG27酶活力單位定義為在上述條件下，每分鐘水解生成1μmol葡萄糖還原當(dāng)量所需的酶量為一個(gè)單位（U）［16］。

1.2.3 Box-Behnken組合實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面分析

對(duì)各因素采用Box-Behnken的中心組合原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行響應(yīng)面分析確定最佳培養(yǎng)基比例，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以（-1，0，1）編碼實(shí)驗(yàn)。本階段實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和模型建立均由Designexpert7.1.6軟件輔助完成。

2 結(jié) 果

2.1 畢赤酵母表達(dá)動(dòng)物內(nèi)源性纖維素酶FG27培

養(yǎng)條件的單因素實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)基組分對(duì)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成有很大影響。不同菌種的最適培養(yǎng)基也不盡相同。為提高FG27的表達(dá)量，對(duì)其培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化研究。首先對(duì)酵母最基礎(chǔ)的3種培養(yǎng)基成分進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1-圖3所示。

圖1 蛋白胨濃度對(duì)FG27表達(dá)量的影響

圖2 葡萄糖濃度與FG27表達(dá)量的影響

圖3 酵母膏濃度對(duì)FG27表達(dá)量的影響

蛋白胨、酵母膏和葡萄糖是酵母生長(zhǎng)的最重要的培養(yǎng)基成分，為其提供了碳源，氮源，生物素等基本物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1示，當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?.5%時(shí)，F(xiàn)G27表達(dá)量達(dá)到最大，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。葡萄糖的影響如圖2示，當(dāng)濃度介于2%～4%時(shí)，F(xiàn)G27的表達(dá)量達(dá)到最大，之后表達(dá)量下降。以上結(jié)果表明，葡萄糖和蛋白胨作為基本的碳源和氮源對(duì)重組FG27的表達(dá)均有明顯的影響，當(dāng)兩者濃度過低時(shí)，F(xiàn)G27表達(dá)量較低，而當(dāng)兩種組分濃度過高時(shí)又一定程度上抑制了表達(dá)量。此外，酵母膏對(duì)重組FG27的影響結(jié)果如圖3示，F(xiàn)G27的表達(dá)量隨酵母膏濃度的增加而緩慢增加，表明酵母膏對(duì)產(chǎn)酶也有一定影響。

2.2 Box-Behnken組合實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面分析

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)蛋白胨、酵母膏和葡萄糖一步優(yōu)化。每個(gè)因素取3個(gè)水平，各因素的水平如表1所示。按照設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果

由Design-Fxpert7.1.6軟件擬合得多項(xiàng)式回歸模型為：

回歸方程方差分析見表3，可信度分析見表4。由表3分析可以看出，模型是高度顯著的，模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為98.54%，說明模型的相關(guān)度很好。變異系數(shù)（CV）反映模型的置信度，CV值越低模型的置信度越高，而本試驗(yàn)的CV值為1.57%，說明模型方程能很好的反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值，因此該模型能很好的預(yù)測(cè)各因素對(duì)FG27產(chǎn)酶的影響。各因素間交互作用對(duì)酶活響應(yīng)的影響曲面和等高線如圖4-6所示。

表3 回歸方程方差分析

表4 模型可信度分析

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)，我們通過Design-Fxpert軟件繪制響應(yīng)面曲線圖來進(jìn)行可視化的分析（圖4-圖6）。從等高線圖可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反，因此葡萄糖與蛋白胨的交互作用最為顯著。

由響應(yīng)面立體圖可以看出，曲面均呈山丘形，即響應(yīng)值存在最大值。進(jìn)一步通過軟件分析計(jì)算，得到最大產(chǎn)量時(shí)的各因素濃度的編碼值：X1=0，X2= 0.03，X3=0.06，對(duì)應(yīng)的實(shí)際濃度分別為，蛋白胨30 g/L，酵母膏60.9 g/L，葡萄糖30.9 g/L，得到模型預(yù)測(cè)的FG27最大產(chǎn)量為353.592 U/L，與實(shí)際測(cè)試值相符。

圖4 酵母粉和蛋白胨對(duì)酶活的響應(yīng)面與等高線

圖5 葡萄糖和蛋白胨對(duì)酶活的響應(yīng)面與等高線

圖6 酵母粉和葡萄糖對(duì)酶活的響應(yīng)面與等高線

3 討 論

纖維素酶廣泛存在于微生物［17］、植物等體內(nèi)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，動(dòng)物自身不能產(chǎn)生纖維素酶，其對(duì)纖維素的水解主要是依靠消化道內(nèi)共生菌和共生原生動(dòng)物完成的。然而1997年Tokuda等［18］的研究卻打破了這一傳統(tǒng)觀點(diǎn)，他們從一種白蟻Nasutitermes takasagoensis的中分離純化到一種具有高比活力的β-1，4-內(nèi)切糖苷酶，近年來相繼在線蟲［19］、貽貝［20］、螯蝦［21］和天牛［22］中發(fā)現(xiàn)了動(dòng)物內(nèi)源性纖維素酶的存在，且均具有較好的酶學(xué)性質(zhì)，如本實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的來源于福壽螺的纖維素酶FG27，該酶具有很好的p H穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。然而，來源于高等生物的酶需經(jīng)過復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后加工過程，這使得動(dòng)物內(nèi)源性纖維素酶難以利用微生物重組表達(dá)，從而限制了其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。因此，通過真核生物酵母對(duì)其進(jìn)行重組表達(dá)和利用微生物發(fā)酵是一種提高動(dòng)物內(nèi)源性纖維素酶產(chǎn)量，降低其生產(chǎn)成本的有效手段，重組酵母培養(yǎng)過程中的各個(gè)因素均會(huì)對(duì)最終產(chǎn)量產(chǎn)生影響，如蛋白胨、葡萄糖等物質(zhì)一方面為生物體生長(zhǎng)提供了基本的能源，另一方面也為目的蛋白的合成提供了原材料。然而由于滲透壓等原因，也使得各種培養(yǎng)基組分配比存在著一個(gè)最優(yōu)的范圍，過高的濃度反而會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，培養(yǎng)過程優(yōu)化需對(duì)產(chǎn)酶條件影響的各因素最佳化，使終產(chǎn)物產(chǎn)率最高。

本文以重組酵母生長(zhǎng)中最重要的培養(yǎng)基組分蛋白胨，酵母膏，葡萄糖為研究對(duì)象，利用單因素實(shí)驗(yàn)確定了各因素的最佳濃度范圍，在此基礎(chǔ)上，采用了Box-Behnken設(shè)計(jì)組合實(shí)驗(yàn)研究對(duì)3種自變量的交互作用對(duì)畢赤酵母重組表達(dá)FG27的影響。由響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)得出，3種組分對(duì)產(chǎn)酶均影響顯著，依據(jù)回歸分析確定發(fā)酵最佳條件為蛋白胨30 g/L，酵母膏60.9 g/L，葡萄糖30.9 g/L，在最佳條件下FG27最高可達(dá)354 U/L。這為進(jìn)一步大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)動(dòng)物內(nèi)源性纖維素酶FG27提供一定的參考。

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Study on Expression of CeIIuIase EG27 through Optimization and Recombination of Pichia Pastoris Based on Response Surface MethodoIogy

GEN Xin-wei，SUN Yi-Lin，ZHANGBo-chao，JIANG Lei，CHEN Wei，ZHAO Fu-kun
（School of Life Science，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

In order to optimize and recombine culture medium conditions in which pichia pastoris expresses animal endogenous cellulose FG27，on the basis of single factor experiment，the content of yeast powder，peptone and glucose in the culture medium served as independent variables and enzyme activity of FG27 served as the response value.Box-Behnken deisgn method was used to study the effects of each independent variable and their interactions on FG27 yield by pichia pastoris.Design-Fxpert software and response surface analysis were combined to optimize the culture medium conditions to confirm the best culture medium conditions.Under such conditions of culture，the highest enzyme yield was 354 U/L.

cellulase；FG27；pichia pastoris；response surface

Q786

A

（責(zé)任編輯：許惠兒）

1673-3851（2014）04-0456-06

2013-10-30

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2013R406021）

耿新偉（1989-），男，河南安陽人，碩士研究生，主要從事分子生物學(xué)和微生物發(fā)酵的研究。

陳 瑋，電子郵箱：cw@zstu.edu.cn