吳重德，何桂強(qiáng)，張娟，周榮清，堵國成，陳堅(jiān)

(1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610065；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是一類可發(fā)酵碳水化合物并以乳酸為主要產(chǎn)物的革蘭氏陽性桿菌或球菌的總稱。作為工業(yè)化的細(xì)胞工廠，乳酸菌菌體及其代謝產(chǎn)物廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、精細(xì)化學(xué)品等工業(yè)領(lǐng)域[1,2]。尤其在食品工業(yè)中，乳酸菌廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)乳制品、香精香料、氨基酸、多糖、生物活性物質(zhì)(葉酸、共軛亞油酸)、防腐劑等[2]。然而乳酸菌在發(fā)酵生產(chǎn)、工業(yè)應(yīng)用以及作為益生菌在人體胃腸道系統(tǒng)中都會面臨各種環(huán)境脅迫，包括酸脅迫、鹽脅迫、鹽脅迫、冷凍脅迫等，這些環(huán)境脅迫嚴(yán)重影響了乳酸菌的生長、代謝以及生理功能，從而影響了食品微生物制造的效率和益生功能的發(fā)揮。因此，如何提高乳酸菌對各種環(huán)境脅迫的抗性，已成為學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界共同關(guān)注的焦點(diǎn)問題。

在各種環(huán)境脅迫中，酸脅迫是對乳酸菌最為嚴(yán)峻的脅迫挑戰(zhàn)之一。在乳酸菌的發(fā)酵生產(chǎn)以及在人體胃液中都會遭遇酸脅迫的影響。酸脅迫條件下，乳酸菌通過調(diào)控胞內(nèi)pH的動(dòng)態(tài)平衡、誘導(dǎo)表達(dá)脅迫應(yīng)激蛋白以及調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的生理功能等減少酸脅迫對細(xì)胞造成的損傷[3-5]。

細(xì)胞膜是將細(xì)胞與外界分開的第一道屏障，在細(xì)胞的生長、代謝、能量傳導(dǎo)以及維持胞內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定等方面具有重要作用；同時(shí)，細(xì)胞膜也是環(huán)境脅迫作用的首要位點(diǎn)[6,7]。因此，保持細(xì)胞膜的功能對于保持細(xì)胞活性，提高細(xì)胞對環(huán)境脅迫的抗性具有重要影響。本論文干酪乳桿菌為研究對象，考察了酸脅迫對細(xì)胞膜生理特性的影響，研究結(jié)果為進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞膜生理功能提升乳酸菌環(huán)境脅迫抗性奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Zhang） 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)張和平教授惠贈(zèng)；MRS培養(yǎng)基 購自O(shè)xoid公司；DPH（1,6-二苯基-1,3,5-己三烯）、嵌二萘（pyrene） 購自Sigma-Aldrich（上海）公司；ONPG（鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷） 購自碧云天生物技術(shù)研究所；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

M6原子吸收分光光度計(jì) 日本島津公司；GC-14A氣相色譜儀 日本島津公司；Q-Mass 910型質(zhì)譜儀 加拿大 Sciex公司；650-60熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；蛋白核酸定量儀 德國Eppendorf公司，UV2450紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司；BIOFLO發(fā)酵罐 美國NBS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物培養(yǎng)條件 以 2%接種量取-70℃甘油貯存液接種于 MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)12-14h后，作為活化種子，以2%接種量將培養(yǎng)好的種子液接種至1.3L發(fā)酵罐中進(jìn)行恒化培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝液量為600mL，溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速100r/min稀釋率為0.1h-1，通過添加2mol/L NaOH控制發(fā)酵罐pH為6.5。

1.2.2 脅迫處理 收集恒化培養(yǎng)至穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞(OD3.0)，離心(10000g，4℃)5min，細(xì)胞經(jīng)0.85%的生理鹽水洗滌兩次后重懸于等體積的pH3.5的MRS培養(yǎng)基中，脅迫不同時(shí)間后測定相關(guān)生理參數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞膜脂肪酸含量的測定 細(xì)胞膜脂肪酸的制備和氣相色譜分析條件按照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。碳鏈長度的計(jì)算按如下公式進(jìn)行：

式中：FAP：脂肪酸組成百分?jǐn)?shù)

C：脂肪酸碳原子數(shù)

1.2.4 細(xì)胞膜流動(dòng)性的測定 細(xì)胞膜側(cè)向擴(kuò)散速率和微黏度的測定按照 Aricha等[9]的方法進(jìn)行。取脅迫后的菌體，調(diào)節(jié)菌體濃度至OD450=0.3，用0.25%甲醛37℃固定0.5h，菌體用0.2mol/L磷酸緩沖液（pH7.4，含 0.25%甲醛）離心洗滌兩次。對于側(cè)向擴(kuò)散的測定，細(xì)胞用0.1-0.5μmol/L二萘于37℃標(biāo)記40min，用熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長335nm，發(fā)射波長373nm（單體）和470nm（二聚體），狹縫均為5nm。根據(jù)熒光探針濃度和470nm波長處熒光強(qiáng)度和373nm波長處熒光強(qiáng)度的比值作圖，斜率即為側(cè)向擴(kuò)散速率Ka。對于微黏度的測定，細(xì)胞用5×10-6mol/L DPH于37℃溫浴1h，用熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度，加偏振裝置。激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長430nm，狹縫均為5nm。熒光偏振度P和微黏度r的計(jì)算公式如下：

式中：

IVV：起偏器和檢偏器光軸同為垂直方向時(shí)所測得的熒光強(qiáng)度；

IVH：起偏器和檢偏器光軸分別為垂直和水平方向時(shí)所測得的熒光強(qiáng)度。

IHV：起偏器和檢偏器光軸分別為水平和垂直方向時(shí)所測得的熒光強(qiáng)度；

IHH：起偏器和檢偏器光軸同為水平方向時(shí)所測得的熒光強(qiáng)度。

P值越大，r值越大，流動(dòng)性越小。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)膜透性的測定 取恒化培養(yǎng)至穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞按照 1.2.2的方法脅迫 1h后用10mmol/L磷酸緩沖液（pH7.4）離心洗滌兩次后重懸于相同緩沖液并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為OD600=1.0，取1mL稀釋的菌液添加OPNG至終濃度為100μg/mL，用分光光度計(jì)測定420nm條件下吸光值隨時(shí)間的變化[10]。

1.2.6 胞內(nèi)金屬離子含量的測定 取5mL恒化培養(yǎng)至穩(wěn)態(tài)的的細(xì)胞按照1.2.2的方法脅迫1h后用超純水離心洗滌（10000g，4℃，5min）三次。棄上清后向沉淀中加入4mL 濃硝酸煮沸直至溶液透明澄清，加水定容至25mL，用原子吸收分光光度計(jì)按照Neves等[11]的方法測定胞內(nèi)Na+、K+和Ca2+離子濃度。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)條件做3個(gè)平行樣，每個(gè)樣品測定均為3次重復(fù)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸脅迫對干酪乳桿菌細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響

圖1考察了干酪乳桿菌在酸脅迫條件下細(xì)胞膜流動(dòng)性的變化。膜的側(cè)向擴(kuò)散速率以嵌二萘為熒光探針，根據(jù)嵌二萘單體和激發(fā)態(tài)二聚體的熒光強(qiáng)度的比值進(jìn)行測定。如圖1A所示，隨著脅迫pH的降低，側(cè)向擴(kuò)散系數(shù)Ka逐漸降低，表明酸脅迫引起細(xì)胞膜側(cè)向擴(kuò)散速率降低；圖1B考察了酸脅迫條件下細(xì)胞膜微黏度的變化，隨著脅迫pH的降低，細(xì)胞膜微黏度逐漸增加，表明細(xì)胞膜流動(dòng)性降低。合適的膜流動(dòng)性對于維持細(xì)胞生理功能具有重要作用，膜的流動(dòng)性與能量轉(zhuǎn)化、物質(zhì)運(yùn)送、信息傳遞等密切相關(guān)，它是膜脂肪酸鏈的構(gòu)造、膜的側(cè)向擴(kuò)散、軸向擴(kuò)散、翻轉(zhuǎn)擴(kuò)散(flip-flop)等的綜合反映[6,12]。當(dāng)對細(xì)胞施加一定的環(huán)境脅迫時(shí)，通常會導(dǎo)致膜的結(jié)構(gòu)、組織以及膜脂的功能發(fā)生一定變化，同時(shí)膜流動(dòng)性降低可以減少乳酸的進(jìn)入對細(xì)胞造成的傷害。

圖1 酸脅迫對細(xì)胞膜側(cè)向擴(kuò)散系數(shù)(A)和微黏度(B)的影響圖柱上方星號表示與對照(脅迫前)比較具有顯著性差異(p＜0.05)Fig. 1 Effects of acid stress on lateral diffusion coefficient (A)and micro-viscosity (B)of cell membrane. Asterisks indicate the level of statistical significance (p＜0.05)in comparison to the control (before acid stress).

2.2 酸脅迫對細(xì)胞膜透性的影響

以O(shè)NPG為內(nèi)膜探針，測定了干酪乳桿菌細(xì)胞內(nèi)膜的透性（圖2）。ONPG是β-半乳糖苷酶的底物，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膜不完整時(shí)ONPG會很快進(jìn)入胞內(nèi)，并被胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶所降解，降解產(chǎn)物呈現(xiàn)黃色并在420nm波長下具有最大吸收峰，因此可以用吸光值的大小和上升速率來評價(jià)內(nèi)膜透性的大小[10]。如圖2所示，隨著時(shí)間的增加，在420nm下的吸光度逐漸增加，經(jīng)酸脅迫后的細(xì)胞具有更高地吸光值和更快地上升速率，表明細(xì)胞經(jīng)酸脅迫后細(xì)胞內(nèi)膜滲透性增加。

圖2 酸脅迫對細(xì)胞內(nèi)膜透性的影響Fig. 2 Effect of acid stress on inner membrane permeability of L. casei.

為了進(jìn)一步對上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)考察了脅迫前后胞內(nèi)金屬離子濃度的變化，如表1所示，所考察的三種金屬離子Na+，K+，Ca2+在脅迫后胞內(nèi)濃度顯著降低，表明細(xì)胞經(jīng)酸處理后細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞膜透性增加。Wu等[4]通過投射電鏡也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)論，經(jīng)酸處理后干酪乳桿菌細(xì)胞膜厚度變薄，表面變得粗糙，部分細(xì)胞膜破裂，并有部分胞內(nèi)物質(zhì)的外溢。

表1 酸脅迫前后胞內(nèi)金屬離子濃度的變化Table 1 Changes in concentrations of intracellular metal ions upon acid treatment

2.3 酸脅迫對細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響

圖3考察了酸脅迫對細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響。如圖所示，酸脅迫引起干酪乳桿菌細(xì)胞膜飽和脂肪酸（C14:0，C15:0，C16:0）比例降低，而不飽和脂肪酸除 C16:1外都有不同程度的增加。進(jìn)一步分析脂肪酸不飽和度和碳鏈長度，結(jié)果表明，隨著脅迫時(shí)間的增加，細(xì)胞膜不飽和度逐漸增加，脅迫45min，不飽和度達(dá)到最大；同時(shí)，脅迫時(shí)間延長，膜脂碳鏈長度逐漸增加，脅迫45min后，碳鏈長度由15.55增加到16.53（圖4）。

圖3 酸脅迫對細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響圖柱上方星號表示與對照(脅迫前)比較具有顯著性差異(p＜0.05)。Fig. 3 Effect of acid stress on membrane fatty acid compositions Asterisks indicate the level of statistical significance (P＜0.05)in comparison to the control(before acid stress).

圖4 酸脅迫下細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度和平均碳鏈長度的變化圖柱上方星號表示與對照(脅迫前)比較具有顯著性差異(p＜0.05)。Fig. 4 Changes in ratio of unsaturated/saturated fatty acids and mean chain length during acid stress. Asterisks indicate the level of statistical significance (P＜0.05)in comparison to the control(before acid stress).

調(diào)節(jié)膜脂肪酸分布是細(xì)胞抵御環(huán)境脅迫的重要機(jī)制之一，當(dāng)面臨環(huán)境脅迫時(shí)，細(xì)胞可以通過改變(1)不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例(不飽和度，U/S ratio)；(2)順式和反式脂肪酸的比例；(3)支鏈和直鏈脂肪酸的比例以及(4)脂肪酸長度來改變細(xì)胞膜脂肪酸的組成[6,13]。本研究的結(jié)果表明酸脅迫引起細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量、不飽和度和脂肪酸碳鏈長度都有一定程度的增加，這一研究結(jié)果與在其他微生物如變形鏈球菌(S. mutans)、格氏鏈球菌(S.gordonii)和唾液鏈球菌(S. salivarius)中報(bào)道的結(jié)果相一致[14,15]。通常增加膜脂的不飽和度需要去不飽和酶的參與，而去不飽和酶是一種依賴于氧的酶，它催化合成不飽和脂肪酸是一個(gè)耗氧的過程，這樣可以減少由酸脅迫引起的氧脅迫對細(xì)胞造成的損傷[16-18]。此外，F(xiàn)ozo和Quivey[14]還報(bào)道了不飽和脂肪酸的形成對于保持胞內(nèi)外的pH梯度具有重要作用。脂肪酸碳鏈長度的改變是改變細(xì)胞膜脂肪酸組成的一種途徑，在口腔細(xì)菌 S. gordonii DL1和 S.salivarius 57.1中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)論[15]。Denich等[6]和Mykytczuk等[19]認(rèn)為鏈長增加更容易橫跨膜雙分子層，使脂肪酸鏈更緊湊，而膜環(huán)境更接近于“凝膠狀”；而短鏈的脂肪酸不能橫跨膜雙分子層，也就不能和其它的脂和蛋白通過疏水關(guān)系結(jié)合，這樣由于游離脂肪酸的移動(dòng)使膜的不穩(wěn)定性增加。因此，增加脂肪酸的不飽和度和碳鏈長度是干酪乳桿菌的一種酸存活機(jī)制。

3 結(jié)論

細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和流動(dòng)性是保持細(xì)胞處于正常生理功能的重要條件。本論文以干酪乳桿菌為研究對象，考察了酸脅迫對細(xì)胞膜生理特性的影響。分別以嵌二萘和DPH為探針，考察了酸脅迫對細(xì)胞側(cè)向擴(kuò)散速率和微黏度的影響。研究結(jié)果表明，隨著脅迫pH的降低，細(xì)胞膜側(cè)向擴(kuò)散速率降低，微黏度增加，表明細(xì)胞膜流動(dòng)性降低。降低的膜流動(dòng)性減少了乳酸進(jìn)入胞內(nèi)對細(xì)胞造成的損傷。同時(shí)研究結(jié)果還表明酸脅迫導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膜透性增加，胞內(nèi)金屬離子濃度顯著降低。分析細(xì)胞膜脂肪酸組分的變化，研究發(fā)現(xiàn)酸脅迫引起膜脂不飽和脂肪酸含量增加，飽和脂肪酸含量降低，不飽和度和脂肪酸碳鏈長度增加。

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