朱森，黃迅悟，梁艷，彭偉，馮會(huì)成，張瑞斐

活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核全血γ-干擾素檢測(cè)結(jié)果分析

朱森1，黃迅悟2a，梁艷2b，彭偉2a，馮會(huì)成2a，張瑞斐1

目的探討全血γ-干擾素(IFN-γ)檢測(cè)在活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核診斷的意義。方法以5種結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白作為刺激蛋白，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光酶免疫分吸附法檢測(cè)35例活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核病患者及35名健康體檢者的全血IFN-γ含量，比較分析5種蛋白刺激時(shí)對(duì)活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核檢測(cè)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比和陰性似然比，評(píng)估其診斷效能。結(jié)果CFP10/ESAT6融合蛋白、Rv2041c蛋白、Rv0057/1352融合蛋白、Rv1419蛋白及Rv1656蛋白刺激時(shí)，全血IFN-γ檢測(cè)靈敏性為77.1%、68.6%、71.4%、74.3%和65.7%，特異性為65.7%、54.3%、57.1%、60.0%和62.9%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為62.9%、60%、62.5%、65%及63.9%，陰性預(yù)測(cè)值為74.2%、63.3%、66.7%、70%及64.7%，陽(yáng)性似然比為2.25、1.5、1.67、1.86及1.77，陰性似然比為0.348、0.579、0.5、0.429及0.545。結(jié)論全血IFN-γ檢測(cè)對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)核有一定參考意義，但不能作為活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核的確診指標(biāo)。

關(guān)節(jié)結(jié)核；γ-干擾素；診斷；結(jié)核分枝桿菌；特異性蛋白

[本文著錄格式]朱森，黃迅悟，梁艷，等.活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核全血γ-干擾素檢測(cè)結(jié)果分析[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2014,20 (12):1175-1178.

近年來(lái)，發(fā)展中國(guó)家關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病率正逐年增加。關(guān)節(jié)結(jié)核早期診斷困難，晚期可導(dǎo)致關(guān)節(jié)毀損，致殘率很高[1]。在臨床研究方面，一期人工關(guān)節(jié)置換能實(shí)現(xiàn)關(guān)節(jié)功能的早期恢復(fù)，是治療活動(dòng)期關(guān)節(jié)結(jié)核的理想方法。目前細(xì)菌學(xué)檢查是結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但檢出陽(yáng)性率較低、耗時(shí)長(zhǎng)、易造成漏診，使患者術(shù)后康復(fù)鍛煉和關(guān)節(jié)功能恢復(fù)困難。影像學(xué)、結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)、抗體檢查、分子診斷方法等都存在一定的局限性，關(guān)節(jié)結(jié)核診斷還沒(méi)有一種快速、靈敏和特異性高的診斷方法。

隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷完善，體外γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-γ release assays,IGRA)作為結(jié)核感染輔助診斷技術(shù)，已在臨床上廣泛使用[2]。IGRA從早期的第一代Quanti FERON-TB(QFT)發(fā)展到目前的第四代T-SPOT.TB試劑盒，主要用于潛伏結(jié)核的篩查，敏感和特異性比結(jié)核菌素試驗(yàn)高[3]，為探討全血γ-干擾素(interferon gamma,IFN-γ)檢測(cè)在活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核診斷的意義，本研究選擇35例活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核患者和35名健康人進(jìn)行比較研究，用5種結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白刺激，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行體外IFN-γ檢測(cè)，評(píng)估在活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年4月～2013年12月解放軍309醫(yī)院骨科收治的35例活動(dòng)性關(guān)節(jié)疾病患者作為實(shí)驗(yàn)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者晚期活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核，有膿腫、死骨和骨破壞，有結(jié)核中毒癥狀，血沉(ESR)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)增高，患者做手術(shù)治療取得病理標(biāo)本，臨床和病理診斷為關(guān)節(jié)結(jié)核。排除標(biāo)準(zhǔn)：早期結(jié)核患者，無(wú)結(jié)核中毒癥狀，未做手術(shù)治療血沉(ESR)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)正常，保守治療的關(guān)節(jié)結(jié)核患者。其中膝關(guān)節(jié)結(jié)核19例，髖關(guān)節(jié)結(jié)核8例，肩關(guān)節(jié)結(jié)核6例，踝關(guān)節(jié)結(jié)核1例，距骨關(guān)節(jié)結(jié)核1例。

同期309醫(yī)院健康體檢志愿者35名為健康對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)結(jié)核病史，胸片檢查肺部無(wú)結(jié)核病灶，ESR、CRP無(wú)異常，近一個(gè)月無(wú)創(chuàng)傷、手術(shù)史。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者近1個(gè)月有發(fā)熱、感冒、上呼吸道感染等炎性癥狀。

兩組一般情況比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料[n(%)]

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑

BD OptEIA Human IFN-γ ELISA SET、陽(yáng)性對(duì)照物PHA 5 mg：SIGMA公司；CFP10/ESAT6融合蛋白、Rv2041c蛋白、Rv1656蛋白、Rv0057/1352融合蛋白、Rv1419蛋白：309醫(yī)院結(jié)核研究所自備；化學(xué)發(fā)光底物液：北京索萊寶科技有限公司；RPMI Medium 1640：北京索萊寶科技有限公司；無(wú)支原體新生牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集

用綠頭肝素鈉抗凝管抽取患者新鮮靜脈血4 ml。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

血液采集后6h內(nèi)加入刺激物，每份標(biāo)本設(shè)陰性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔和5個(gè)蛋白檢測(cè)孔，每個(gè)蛋白工作濃度160μg/ml(終濃度為20μg/ ml)。在37℃溫箱培養(yǎng)18～24h。

1.3.3 離心

把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱取出，吸取培養(yǎng)物于1.5 ml離心，3000 r/min，共5min，分離上清。把上清液封存于-80℃冰箱。

1.3.4 抗原包被

用包被液將捕獲抗體CaptureAntibody按1∶250稀釋為4 μg/ml，每孔加100μl，置4℃冰箱過(guò)夜。

1.3.5 封閉

倒掉包被液，用PBS-T(PBS-0.05%Tween20，新鮮配制或3 d內(nèi)準(zhǔn)備)洗板3次，浸泡3min次。最后一次將板拍干。每孔加PBS-10%胎兒牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS熱滅活，新鮮配制或3 d內(nèi)準(zhǔn)備)200 μl，37℃孵育1 h。用PBS-T洗板3次，浸泡3min/次，最后一次將板拍干。

1.3.6 加樣

每孔加入100 μl分離上清(1∶5稀釋)和各濃度標(biāo)準(zhǔn)品，37℃放置2 h，洗板5次，浸泡3min/次，最后一次將板拍干。

1.3.7 加入檢測(cè)抗體稀釋的鏈親和素-辣根過(guò)氧化物酶(Avidin-horseradish peroxidase conjugate)

10%FBS-PBS 1∶250稀釋檢測(cè)抗體Detection Antibody(Biotinylated Anti-human IFN-γ稀釋為4 μg/ml)，再用稀釋的檢測(cè)抗體1∶250稀釋鏈親和素-辣根過(guò)氧化物酶每孔加100μl，置37℃孵育1 h。用PBS-T洗板7次，浸泡3min/次。最后一次將板拍干。

1.3.8 加底物液(Substrate Slution)

用前15min將A與B試劑按1∶1配制底物液，每孔加100 μl，立即放入化學(xué)發(fā)光分析儀5min后讀取發(fā)光值，用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算標(biāo)本中IFN-γ的量。

1.3.9 陰陽(yáng)性的判定

實(shí)驗(yàn)組和健康對(duì)照組全血中結(jié)核特異性IFN-γ水平，以Youden指數(shù)(敏感性+特異性-1)最大時(shí)IFN-γ含量為活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核病診斷的臨界值，大于臨界值判斷為陽(yáng)性，小于臨界值為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 IFN-γ檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率

CFP10/ESAT6融合蛋白和Rv1419蛋白為刺激蛋白時(shí)，兩組IFN-γ檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率有非常顯著性差異(P＜0.01)；Rv0057/1352融合蛋白和Rv1656蛋白為刺激蛋白時(shí)，兩組FN-γ檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率有顯著性差異(P＜0.05)；而Rv2041c蛋白為刺激蛋白時(shí)，兩組IFN-γ檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 5種蛋白刺激時(shí)IFN-γ檢測(cè)在兩組中的陽(yáng)性檢出率(%)

2.2 全血IFN-γ檢測(cè)的敏感性、特異性及診斷指數(shù)

CFP10/ESAT6融合蛋白為刺激蛋白時(shí)，IFN-γ檢測(cè)的效能最大。見(jiàn)表3。

2.3 5種蛋白刺激時(shí)IFN-γ檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比及陰性似然比的比較

CFP10/ESAT6融合蛋白為刺激蛋白時(shí)，IFN-γ檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果時(shí)為真陽(yáng)性的概率最大；IFN-γ檢測(cè)的陰性結(jié)果時(shí)為真陰性的概率最大。見(jiàn)表4。

表3 5種蛋白刺激時(shí)IFN-γ檢測(cè)的敏感性、特異性及診斷指數(shù)

表4 5種蛋白刺激時(shí)全血IFN-γ檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比及陰性似然比

3 討論

人體感染結(jié)核分枝桿菌后，體內(nèi)T淋巴細(xì)胞被致敏，再次受到結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后，致敏T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ[4]。IGRA利用此原理，將結(jié)核分枝桿菌感染患者血液經(jīng)含有結(jié)核分枝桿菌抗原的蛋白刺激后，測(cè)定T細(xì)胞IFN-γ釋放反應(yīng)，可判斷患者是否感染結(jié)核分枝桿菌。IGRA檢測(cè)結(jié)核感染的方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)，該研究應(yīng)用的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附法是改良的ELISA，標(biāo)本可以重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)周期耗時(shí)短，選取的5種刺激蛋白已在肺結(jié)核檢測(cè)中應(yīng)用[5-8]。目前國(guó)內(nèi)外常用的結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白是ESAT-6和CFP-10。本實(shí)驗(yàn)選用的CFP10/ESAT6融合蛋白集合了二者的優(yōu)點(diǎn)，沒(méi)有卡介苗菌株編碼基因，可以避免卡介苗接種后的假陽(yáng)性結(jié)果；Rv1419編碼分子量為13 kDa分泌性凝集素，此抗凝素存在于結(jié)核分枝桿菌H37Rv培養(yǎng)濾液中，在活動(dòng)性肺結(jié)核診斷中有一定意義；Rv1656蛋白屬于結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全細(xì)胞裂解物，是一種改進(jìn)的抗原，有可能用于鑒別隱性感染者和活動(dòng)性肺結(jié)核。

本研究以CFP10/ESAT6融合蛋白和Rv1419蛋白為刺激蛋白，在實(shí)驗(yàn)組IFN-γ檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率為77.1%和74.3%，健康組陽(yáng)性檢出率為34.3%和40.0%，兩組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)；Rv0057/1352融合蛋白和Rv1656蛋白為刺激蛋白時(shí)，IFN-γ檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)組的陽(yáng)性檢出率為71.4%和65.7%，健康組陽(yáng)性檢出率為42.9%和37.1%，兩組比較有顯著性差異(P＜0.05)；而Rv2041c蛋白為刺激蛋白時(shí)，在實(shí)驗(yàn)組和健康組IFN-γ檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率為68.6%和45.7%，兩組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)感染菌[9]，T細(xì)胞不能直接作用于胞內(nèi)菌，結(jié)核分支桿菌感染所致的細(xì)胞免疫受多種因素影響，從而影響IGRA。兒童、并發(fā)艾滋病病毒(HIV)感染等免疫功能不全患者、應(yīng)用免疫抑制劑及抗腫瘤壞死因子治療患者，T淋巴細(xì)胞功能受限制，盡管有活動(dòng)性結(jié)核感染，IFN-γ檢測(cè)也可能陰性。假陰性結(jié)果使術(shù)后康復(fù)的成本增加，不利于患者功能恢復(fù)。世界范圍內(nèi)隱性結(jié)核感染者超過(guò)總?cè)丝诘?/3，隱性結(jié)核感染患者IFN-γ檢測(cè)會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。此外，某些非結(jié)核分枝桿菌抗原與IGRA刺激蛋白抗原相同。這些非結(jié)核分枝桿菌感染者、獸醫(yī)或花農(nóng)等長(zhǎng)期暴露于分枝桿菌環(huán)境職業(yè)人員，IGRA可以呈陽(yáng)性反應(yīng)。假陰性結(jié)果使患者不能有效抗結(jié)核治療，患者可能結(jié)核感染復(fù)發(fā)，導(dǎo)致術(shù)后康復(fù)鍛煉和關(guān)節(jié)功能恢復(fù)失敗。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5種蛋白刺激時(shí)IFN-γ檢測(cè)的敏感性和特異性范圍為65.7%～77.1%和54.3%～65.7%，此研究結(jié)果與國(guó)外研究報(bào)道QFT試劑盒檢測(cè)潛伏結(jié)核的敏感性為70%～80%[10]、結(jié)核酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)特異性為58%～61.9%[11]相近，表明IFN-γ檢測(cè)對(duì)活動(dòng)性結(jié)核診斷有一定參考意義，但診斷指數(shù)范圍為122.9%～142.8%，均小于150%，診斷效能不高。5種蛋白刺激時(shí)檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值范圍為60.0%～69.2%和63.3%～74.2%，表明IFN-γ檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果不能作為確診活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核的指標(biāo)，陰性結(jié)果不能作為排除活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核的指標(biāo)。5種蛋白刺激時(shí)檢測(cè)的陽(yáng)性似然比均小于10，陰性似然比均大于0.1，表明陽(yáng)性結(jié)果診斷活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核的可能性大，而陰性結(jié)果診斷活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核的可能性小。因此，IFN-γ檢測(cè)只能作為一種輔助診斷的手段，不能作為確診指標(biāo)。

本研究存在很大的局限性，如患者來(lái)源受限制，研究的樣本量少，可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響。

綜上所述，IFN-γ檢測(cè)對(duì)活動(dòng)性關(guān)節(jié)結(jié)核有一定的參考意義，只能作為一種輔助診斷，不能作為確診指標(biāo)。為進(jìn)一步確診疾病，應(yīng)結(jié)合病理診斷、臨床癥狀及其相關(guān)檢查，以便于關(guān)節(jié)結(jié)核患者一期置換，為早期康復(fù)和恢復(fù)關(guān)節(jié)功能奠定基礎(chǔ)。

[1]黃迅悟,馮會(huì)成,孫繼桐,等.活動(dòng)性髖關(guān)節(jié)結(jié)核一期病灶清除全髖關(guān)節(jié)置換28例報(bào)告[J].中華骨科雜志,2013,33(5): 495-500.

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Testing Result of Active Joint Tuberculosis's Whole Blood Interferon-γ Assay

ZHU Sen,HUANG Xun-wu,LIANG Yan,PENG Wei, FENG Hui-cheng,ZHANG Rui-fei.Department of Orthopedics,Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China

ObjectiveTo discuss the significance of the detection of interferon-γ in the diagnosis of active joint tuberculosis.Methods5 kinds of specific proteins of mycobacterium tuberculosis were used as stimulating protein,the chemiluminescence enzyme immunoassay was used to test the content of interferon-γ.The interferon-γ of 35 cases of patients with active joint tuberculosis and 35 cases of healthy people were detected.The difference of the sensitivity,specificity,positive predictive value,negative predictive value,positive likelihood ratio and negative likelihood ratio of 5 kinds of proteins to the diagnostic of active joint tuberculosis were compared.ResultsCFP10/ESAT6 fusion protein,Rv2041c protein,Rv0057/1352 fusion proteins,Rv1419 protein and Rv1656 protein were used as stimulating protein,the sensitivities of active joint tuberculosis by the whole blood interferon-γ assay were 77.1%,68.6%,71.4%,74.3%and 65.7%.The specificities were 65.7%,54.3%,57.1%,60.0%and 62.9%.The positive predictive values were 62.9%,60%,62.5%,65%and 63.9%.The negative predictive values were 74.2%,63.3%,66.7%,70%and 64.7%.The positive likelihood ratios were 2.25,1.5,1.67,1.86 and 1.77.The negative likelihood ratios were 0.348,0.579,0.5,0.429 and 0.545.ConclusionThe detection of interferon-γ has certain significance to joint tuberculosis.But it is not as an index of diagnosing joint tuberculosis.

joint tuberculosis;interferon-gamma;diagnosis;mycobacterium tuberculosis;specific proteins

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.12.021

R529.2

A

1006-9771(2014)12-1175-04

2014-04-09

2014-06-14)

首都臨床特色應(yīng)用研究項(xiàng)目(No.Z1211070010112094)。

1.河北北方學(xué)院，河北張家口市075000；2.解放軍第309醫(yī)院，a.關(guān)節(jié)外科，b.結(jié)核研究所，北京市100091。作者簡(jiǎn)介：朱森(1986-)，男，漢族，河北滿城縣人，碩士研究生，主要研究方向：關(guān)節(jié)外科。通訊作者：黃迅悟(1963-)，男，漢族，河北玉田縣人，主任醫(yī)師，主要研究方向：關(guān)節(jié)外科。E-mail:hxw_309@163.com。