羅開源，鐘小明，余鴻

骨髓基質(zhì)細胞植入對腦缺血大鼠海馬齒狀回突觸形成及記憶能力的影響

羅開源1，鐘小明1，余鴻2

目的探討骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)經(jīng)側(cè)腦室植入腦缺血大鼠后海馬齒狀回突觸形成及大鼠記憶能力的變化。方法大鼠BMSCs培養(yǎng)3代。60只新生Sprague-Dawley大鼠分為假手術(shù)組、模型組、細胞組各20只，后兩組結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，細胞組于7 d后經(jīng)側(cè)腦室植入BMSCs。8周后行Morris水迷宮測試。測試后取腦組織，免疫組織化學(xué)染色檢測海馬齒狀回處突觸素表達。結(jié)果模型組探查訓(xùn)練(T1)和對位探查訓(xùn)練(T2)時間均較假手術(shù)組縮短(P＜0.05)；細胞組T1和T2分別較模型組延長(P＜0.05)。模型組大鼠海馬突觸素陽性細胞積分光密度值(IOD)較假手術(shù)組減小(P＜0.05)，細胞組IOD較模型組增加(P＜0.05)。結(jié)論BMSCs經(jīng)側(cè)腦室植入可促進腦缺血大鼠海馬齒狀回突觸形成，并改善其記憶功能。

骨髓基質(zhì)細胞；移植；缺血；腦損傷；突觸；記憶

[本文著錄格式]羅開源，鐘小明，余鴻.骨髓基質(zhì)細胞植入對腦缺血大鼠海馬齒狀回突觸形成及記憶能力的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2014,20(12):1122-1125.

腦缺血是臨床危重癥之一，以新生兒及老年人多發(fā)，常導(dǎo)致肢體運動功能障礙、智力低下、癲癇，嚴重威脅人類健康。近年來報道，植入骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)能促進腦損傷大鼠神經(jīng)元再生，短期內(nèi)能促進腦損傷大鼠的運動功能。但細胞移植后再生的神經(jīng)元是否與其他細胞形成聯(lián)系，以及移植BMSCs對腦缺血大鼠神經(jīng)功能的中長期療效還不清楚。本實驗將BMSCs經(jīng)側(cè)腦室植入腦缺血大鼠，通過監(jiān)測突觸標(biāo)志物變化，探討腦缺血大鼠海馬齒狀回突觸形成，進一步闡明BMSCs移植治療腦缺血的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

7日齡Sprague-Dawley大鼠(一級，許可證號：川實動管質(zhì)第17號)。

1.2 主要實驗試劑

兔抗CD44一抗、兔抗CD34一抗、多聚酶聯(lián)羊抗鼠二抗(PV)試劑盒：北京中杉生物技術(shù)有限公司。小鼠抗突觸素一抗：杭州華安生物技術(shù)有限公司。多聚酶聯(lián)羊抗兔二抗(PV)試劑盒：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要實驗儀器

Ax-70熒光顯微成像系統(tǒng)：日本OLYMPUS公司。Morris水迷宮跟蹤系統(tǒng)：成都泰盟公司。Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)：MEDIA CYBERNETICS公司。Leica DM IRB熒光倒置顯微鏡：德國LEICA公司。

1.4 BMSCs的培養(yǎng)和鑒定

全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠BMSCs。傳代培養(yǎng)3代，制成單細胞懸液，1×105/孔接種到六孔板培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察。第5天取出蓋玻片，多聚甲醛固定，3%雙氧水封閉，用兔抗鼠CD44、兔抗鼠CD34多克隆抗體(一抗)、FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗，免疫組織化學(xué)法鑒定BMSCs。

1.5 動物分組及造模

60只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、細胞組各20只。模型組和細胞組大鼠于相對無菌環(huán)境下，參照Rice方法，結(jié)扎左側(cè)頸總動脈(造模成功率42.7%，造模不成功未列入實驗計數(shù))。假手術(shù)組僅暴露左頸總動脈，但不結(jié)扎。

術(shù)后24 h，選1～2只大鼠取腦組織常規(guī)HE染色；其余大鼠術(shù)后72 h，行大鼠行為學(xué)檢測。

1.6 側(cè)腦室移植

各組術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)1周，模型組和假手術(shù)組低溫麻醉，在腦立體定位系統(tǒng)的指示下(坐標(biāo)AP-0.5 mm，ML-2 mm，DV-2 mm)左側(cè)腦室注入0.01 mol/L無菌PBS液2 μl；細胞組注入等量105/μl BMSCs。

1.7 Morris水迷宮測試

將喂養(yǎng)至8周齡的大鼠行水迷宮測試。其中獲得性訓(xùn)練5 d，第6天行探查訓(xùn)練測試(T1)；然后行對位訓(xùn)練4 d，第11天進行對位探查訓(xùn)練測試(T2)。均記錄大鼠在目標(biāo)象限的搜索時間。

1.8 突觸素檢測

水迷宮測試結(jié)束當(dāng)天，麻醉后頸椎脫臼處死大鼠，取腦組織，固定、脫水、包埋、切片，免疫組化染色(PV法)，檢測左側(cè)齒狀突觸素回陽性細胞表達。

各切片熒光顯微成像系統(tǒng)下照相，400倍下分析海馬齒狀回顆粒細胞層3個視野(3×5 mm)。Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，統(tǒng)計其陽性細胞積分光密度(integral optical density,IOD)值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。對各指標(biāo)分別作正態(tài)分布和方差齊性檢驗。數(shù)據(jù)以(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較用LSD檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的培養(yǎng)和純化

細胞接種24 h后，倒置顯微鏡下觀察可見大圓形單核細胞貼壁生長。換液后去除大量懸浮細胞。每3天換液1次。36～48 h貼壁細胞逐漸增多。72 h后細胞開始增殖。5～6 d可見細胞增殖形成明顯的集落，呈纖維狀，10～12 d各集落逐漸融合，細胞呈單層生長。傳代后細胞開始變圓，迅速貼壁，伸展成纖維狀并且生長加快，細胞可呈現(xiàn)有序的漩渦狀生長。傳3～5代后雜質(zhì)細胞逐漸減少，纖維狀細胞占99%以上，可用于移植(圖1)。

CD44免疫熒光顯示，CD44陽性率95%以上，未見CD34陽性細胞(圖2)。

圖1 第3代BMSCs(倒置顯微鏡,200×)

圖2 CD44陽性BMSCs(免疫熒光染色,200×)

2.2 模型鑒定結(jié)果

術(shù)后24 h，大鼠腦組織左側(cè)(結(jié)扎側(cè))出現(xiàn)顯著病理變化，海馬區(qū)出現(xiàn)明顯神經(jīng)元壞死。術(shù)后72 h出現(xiàn)左側(cè)Horner癥；行走困難，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈。造模成功。

2.3 Morris水迷宮測試

模型組大鼠T1和T2均較假手術(shù)組縮短(P＜0.05)，而細胞組大鼠T1和T2均較模型組延長(P＜ 0.05)(表1)。

2.4 海馬突觸素表達

突觸素陽性細胞胞質(zhì)為棕黃色，多數(shù)細胞分界不清，陽性物質(zhì)多呈顆粒狀分布，且集中于多形層。假手術(shù)組陽性顆粒深染、密集；模型組陽性顆粒淺染，數(shù)量減少；細胞組陽性顆粒染色較模型組明顯增強，陽性顆粒清晰，數(shù)量增多(圖3)。各組IOD值見表2。

表1 各組Morris水迷宮目標(biāo)象限的搜索時間(s)

表2 各組大鼠海馬突觸素表達(IOD)

圖3 各組突觸素陽性細胞(免疫組化染色,400×)

3 討論

BMSCs存在于骨髓間質(zhì)中，具有自我復(fù)制和多向分化潛能，在特定條件下能分化成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞和神經(jīng)細胞等[1-2]。取材方便是BMSCs另一大優(yōu)點，因此，BMSCs移植治療神經(jīng)損傷成為近年的研究熱點。

Lu等將BMSCs經(jīng)靜脈注射到腦損傷72 h后的大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)移植的細胞在移植后不同時間遷移到損傷側(cè)大腦皮質(zhì)，并表達各種中樞膠質(zhì)細胞標(biāo)記物，大鼠的運動功能也有明顯改善[3]。但目前研究表明，膠質(zhì)細胞的主要功能是支持、營養(yǎng)神經(jīng)元和穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境，膠質(zhì)細胞的增長并不能直接解釋損傷大鼠的運動功能改善。

缺血性腦損傷修復(fù)不僅需要修復(fù)神經(jīng)細胞，修復(fù)的神經(jīng)元能否與周圍細胞建立聯(lián)系是細胞實現(xiàn)功能的關(guān)鍵[4]。本實驗將BMSCs植入缺血性損傷大鼠側(cè)腦室后，突觸素免疫組化結(jié)果顯示細胞組海馬齒狀回陽性物質(zhì)較模型組大鼠明顯增多。突觸素是一種位于突觸囊泡膜上的鈣結(jié)合蛋白，在鈣依賴性神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中起重要作用，是突觸發(fā)生的標(biāo)志；表達增加說明神經(jīng)細胞之間形成的突觸聯(lián)系增多。Morris水迷宮提示細胞組大鼠T1和T2均較模型組大鼠延長，說明細胞組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較模型組大鼠增強。

BMSCs可能是通過兩個途徑促使突觸增多。①有研究表明，BMSCs注入成體大鼠側(cè)腦室后，轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元[5]，轉(zhuǎn)化后的神經(jīng)元與周圍神經(jīng)元通過突觸建立聯(lián)系，突觸素明顯增加。這與Pang等發(fā)現(xiàn)移植的BMSCs能直接促進周圍神經(jīng)突生長，且與小劑量超短波可能有協(xié)同作用[6]相似。②移植的BMSCs沒有轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細胞，而是分泌神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、腦源性神經(jīng)生長因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等，這些因子既可調(diào)節(jié)自體神經(jīng)干細胞的增殖、分化[7-8]。其中bFGF、NGF、BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子還可以減少腦缺血后缺血半影區(qū)神經(jīng)細胞丟失[9]。

[1]Edamura K,Kuriyama K,Kato K,et al.Proliferation capacity, neuronal differentiation potency and microstructures after the differentiation of canine bone marrow stromal cells into neurons[J].J Vet Med Sci,2012,74(7):923-927.

[2]Haghani K,Bakhtiyari S,NouriAM.In vitro study of the differentiation of bone marrow stromal cells into cardiomyocyte-like cells[J].Mol Cell Biochem,2012,361(1-2):315-320.

[3]Lu J，Moochhala S，Moore XL，et al.Adult bone marrow cells differentiate into neural phenotypes and improve functional recovery in rats following traumatic brain injury[J].Neurosci Lett,2006,398(1-2):12-17.

[4]Back SA,Han BH,Luo NL,et al.Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia-ischemia[J].Neuroscience,2002,22(2):455-463.

[5]Arnhold S,Klein H,Klinz FJ,et al.Human bone marrow stroma cells display certain neural characteristics and integrate in the subventricular compartment after injection into the liquor system[J].Eur J Cell Biol,2006,85(6):551-565.

[6]Pang CJ,Tong L,Ji LL,et al.Synergistic effects of ultrashort wave and bone marrow stromal cells on nerve regeneration with acellular nerve allografts[J].Synapse,2013,67(10): 637-647.

[7]Munoz JR,Stoutenger BR,Robinson AP,et al.Human stem progenitor cells from bone marrow promote neurogenesis of endogenous neural stem cells in the hippocampus of mice[J]. Proc NatlAcad Sci,2005,102(50):18171-18176.

[8]Zhang C,Li Y,Chen J,et al.Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4,gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats[J].Neuroscience,2006,141(2):687-695.

[9]Lee J,Duan W,Wattson MP.Evidence that brain-derived neurotrophic factor is required for basal neurogenesis and mediates, in part,the enhancement of neurogenesis by dietary restriction in the hippocampuss of adult mice[J].J Neurochem,2002,82 (6):1367-1375.

Effect of Bone Marrow Stromal Cells Transplantation on Synapse Formation in Dentate Gyrus and Memory in Rats with Ischemic Brain Injury

LUO Kai-yuan,ZHONG Xiao-ming,YU Hong.Department of Pediatrics,The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College,Ganzhou,Jiangxi 341000,China

ObjectiveTo observe the synapse formation in hippocampal dentate gyrus,and the memory ability after transplanting bone marrow stromal cells(BMSCs)into lateral ventricle of ischemic brain injury rats.MethodsBMSCs from femur of a Sprague-Dawley rat were cultured for 3 generations in vitro.60 newborn Sprague-Dawley rats were divided into sham group(n=20),model group(n=20)and BMSCs group(n=20).The latter 2 groups were ligated the left common carotid artery,and the BMSCs group were injected BMSCs into the lateral ventricle 7 days after ligation.They were tested with Morris's water maze 8 weeks later,and then,the brains were immunohistochemical staining to detect synaptophysin(SY).ResultsThe time of probe trial of acquisition phase(T1)and reveral phase(T2)decreased in the model group compared with the sham group(P＜0.05),and increased in the BMSCs group compared with the model group(P＜0.05).The integral optical density(IOD)of SY positive cells decreased in the model group compared with the sham group(P＜0.05),and increased in the BMSCs group compared with the model group(P＜0.05).ConclusionBMSCs implantation through lateral ventricle can improve the learning and memory ability of rats,which may associated with the synapse formation in dentate gyrus.

bone marrow stromal cells;transplantation;ischemia;brain injury;synapse;memory

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.12.006

R743.31

A

1006-9771(2014)12-1122-04

2014-05-12

2014-06-16)

四川省瀘州市科技局課題〔No.2008-S-12(4/4)〕。

1.江西省贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，江西贛州市341000；2.四川省瀘州醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室，四川瀘州市646000。作者簡介：羅開源(1966-)，男，江西贛州市人，主任醫(yī)師，主要研究方向：小兒神經(jīng)康復(fù)。通訊作者：余鴻(1968-)，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：神經(jīng)發(fā)育生物學(xué)。E-mail:617913773@qq.com。