蘇玉金，趙育梅，顧漪

·基礎研究·

腺相關病毒及慢病毒載體對骨髓間充質(zhì)干細胞基因轉(zhuǎn)染效率的比較

蘇玉金，趙育梅，顧漪

目的比較腺相關病毒(AAV)載體和慢病毒(LV)載體在間充質(zhì)干細胞(MSCs)基因轉(zhuǎn)染中的效率。方法密度梯度離心法分離培養(yǎng)MSCs，HE染色、Nestin免疫熒光染色鑒定，BrdU標記觀察增殖情況。分別包裝AAV與LV假病毒顆粒，并感染MSCs，通過β-gal染色和綠色熒光蛋白檢測，分別計算兩者的轉(zhuǎn)染效率。結果MSCs成功從骨髓分離。AAV載體介導的基因轉(zhuǎn)染率為49.1%，LV載體的轉(zhuǎn)染率為91.4%(P＜0.01)。結論LV載體介導的基因轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染效率更高。

基因轉(zhuǎn)染；腺相關病毒載體；慢病毒載體；骨髓間充質(zhì)干細胞

[本文著錄格式]蘇玉金，趙育梅，顧漪.腺相關病毒及慢病毒載體對骨髓間充質(zhì)干細胞基因轉(zhuǎn)染效率的比較[J].中國康復理論與實踐,2014,20(12):1117-1121.

骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是造血微環(huán)境的重要組成成分，可以分泌多種與造血有關的正負調(diào)控因子，發(fā)揮調(diào)控造血的作用。本世紀初發(fā)現(xiàn)BMSCs具有干細胞的特征，且具有多向分化的潛能，屬于多能干細胞[1]。在體外特定培養(yǎng)條件下，BMSCs可以分化為成骨細胞[2]、軟骨細胞、脂肪細胞[3]以及成肌細胞等間充質(zhì)細胞，因此人們亦將之稱為間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)[4]；近年來發(fā)現(xiàn)，MSCs還可以分化為星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元[5-6]。由于具有多向分化潛能，而且可以自體取材、自體移植，無免疫排斥反應，所以BMSCs細胞是基因治療潛在的理想工具，在細胞與基因治療中有著廣闊的應用前景[7]。

基因療法有多種形式，可以將基因直接引入體內(nèi)，也可以通過運載細胞攜帶治療基因，通過細胞移植來治療疾病。運載細胞攜帶目的基因的療法，限制其應用的關鍵瓶頸在于基因的轉(zhuǎn)染效率。本文比較腺相關病毒(adeno-associated viral,AAV)與慢病毒(lentiviral,LV)介導的基因轉(zhuǎn)染效率。

1 材料與方法

1.1 細胞系

攜帶pAAV-helpe和pAAV-RC的人胚腎細胞HEK293(ATCC,Catalog#CRL-1573)包裝細胞系；用于檢測AAV病毒滴度的人纖維肉瘤細胞HT1080(ATCC,Catalog#CCL-121)。

1.2 主要試劑

HEK293轉(zhuǎn)染試劑CaCl2、Na2HPO4、HEPES和NaCl，3,3'-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)：SIGMA公司。β-Galactosidase：北京鼎國生物技術有限公司。羥基脲和丁酸鈉：SIGMA-ALDRICH公司。小鼠抗人TH單克隆抗體、生物素化山羊抗鼠IgM與辣根酶標記鏈霉卵白素：北京中杉金橋生物技術有限公司。LV病毒液：上海吉盛制藥有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 MSCs分離與培養(yǎng)

成年雄性SD大鼠斷頭處死，常規(guī)消毒四肢及胸部皮膚，迅速取出四肢骨及胸骨。以預冷的PBS(含青霉素1×105U/L、鏈霉素0.1 g/L)沖洗兩遍，7號注射針頭吸取無血清α-MEM沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞沖洗液。細胞沖洗液小心加于2倍體積的淋巴細胞分離液上，室溫2500 r/min離心25min。用吸管吸取液面交界處云霧狀液體，放入盛有PBS 5 ml的離心管中，充分混勻，室溫800 r/mmin離心5min。棄上清液，管內(nèi)沉淀用PBS沖洗1遍，以含有20%胎牛血清的α-MEM重新懸浮細胞，接種至50 ml塑料培養(yǎng)瓶，置5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后換液。

1.3.2 BrdU標記與檢測

待細胞長至50%融合時，吸棄培養(yǎng)基，加入BrdU標記培養(yǎng)基，5%CO237℃培育60min。吸棄BrdU標記培養(yǎng)基，清洗緩沖液沖洗3遍。乙醇固定液-20℃固定20min，緩沖液沖洗3遍。加入抗小鼠的熒光抗體工作液，37℃培育30min。緩沖液沖洗3遍。透明封片，于熒光倒置顯微鏡下觀察。激發(fā)光波長450～500 nm，發(fā)射光波長515～565 nm。

1.3.3 AAV介導的基因轉(zhuǎn)染

磷酸鈣法將pAAV-lacZ、pAAV-helper、pAAV-RC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進HEK293細胞。轉(zhuǎn)染后2 d收獲病毒。將轉(zhuǎn)染后的細胞連同培養(yǎng)基一同轉(zhuǎn)移入直徑15 ml的圓錐形管中。在液氮和37℃水浴中反復凍融4次，室溫10,000 g離心10min以去除細胞碎屑。將上清轉(zhuǎn)移入新的無菌管中。利用獲得的假病毒顆粒感染HT1080細胞并計算病毒滴度。

MSCs接種后24 h，棄掉培養(yǎng)基，換上述收獲的病毒上清感染細胞。2 d后，4%多聚甲醛固定，β-gal染色。

1.3.4 LV介導的基因轉(zhuǎn)染

MSCs接種后24 h，棄掉培養(yǎng)基，更換為由吉凱基因公司包裝的慢病毒病毒上清(滴度為2×108/ml)。2 d后，直接在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表達。

1.3.5 轉(zhuǎn)染細胞BrdU標記與檢測

待細胞長至80%融合時，吸棄培養(yǎng)基，加入BrdU標記培養(yǎng)基，5%CO237℃培育40min。吸棄BrdU標記培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍。4%多聚甲醛-20℃固定20min。PBS沖洗3遍，加入抗小鼠熒光抗體工作液，37℃培育30min。PBS沖洗3遍后透明封片。熒光倒置顯微鏡下觀察。激發(fā)光波長450～500 nm，發(fā)射光波長515～565 nm。

1.3.6 Nestin免疫化學染色

將BMSCs接種到蓋玻片上，生長24 h后，取出蓋玻片，放入PBS中沖洗1遍。4%多聚甲醛固定。10%山羊血清封閉30min，加入小鼠抗大鼠Nestin單克隆抗體(對照組不加抗體，以PBST代替)，濃度1∶2000，4℃過夜。次日晨棄一抗，PBST沖洗3遍，入二抗(1∶500)，室溫孵育2 h。棄二抗，PBST沖洗3遍，入三抗(1∶200)，室溫孵育1 h。DAB顯色。透明封片，倒置顯微鏡下觀察照相。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 MSCs的鑒定

通過密度梯度離心法分離獲得的細胞呈貼壁生長，形態(tài)不均一，以梭形為主，少部分呈多邊形等不規(guī)則形狀(圖1A)。HE染色顯示，細胞胞核較大，核仁1～3個，核漿比例大(圖1B)。BrdU標記可見絕大多數(shù)的細胞均被標記(圖1C、圖1D)。少部分細胞Nestin染色陽性(圖1E、圖2F)。

2.2 AAV介導的基因轉(zhuǎn)染效率

2.2.1 AAV假病毒顆粒的包裝

通過磷酸鈣法將AAV病毒載體及其輔助質(zhì)粒導入HEK293細胞。轉(zhuǎn)染后48 h,可見細胞培養(yǎng)液明顯變黃，細胞接近100%融合。β-gal染色后，光學顯微鏡下可見大量細胞藍染，部分藍染細胞呈小圓球形；高倍鏡下可見陽性細胞的胞漿和胞核均藍染，無明顯差異(圖2A)。

2.2.2 AAV病毒滴度檢測

將AAV-LacZ病毒包裝液按1∶10稀釋后感染HT 1080細胞，在10-9稀釋梯度仍可以見到經(jīng)呈藍染的LacZ陽性細胞(圖2B)。經(jīng)計算，所獲得的AAV病毒滴度為107/ml。

2.2.3 AAV假病毒顆粒感染MSCs的情況

光鏡下可見大多數(shù)MSCs細胞呈現(xiàn)藍染(圖2C)。經(jīng)計算，感染率為(49.1±6.5)%。

2.3 LV介導的MSCs基因轉(zhuǎn)染效率

熒光顯微鏡下觀察，可見絕大多數(shù)細胞均表達GFP(圖3)。經(jīng)計算，感染率為(91.4±7.6)%。與AAV相比，LV的感染率更高(n=3,P=0.002)。

圖1 間充質(zhì)細胞的生物學特性鑒定(200×)

圖2 AAV介導的基因轉(zhuǎn)染

圖3 LV介導的基因轉(zhuǎn)染MSCs(200×)

3 討論

目前有很多疾病，如帕金森病、亨廷頓病等病因不明，缺乏有效的治療手段。近年來興起的細胞移植與基因療法成為未來治愈這些疾病最有希望的治療方法。但細胞與基因治療中存在著兩個十分關鍵的問題[8-10]：①運載細胞與宿主之間存在免疫排斥反應；②基因轉(zhuǎn)染效率低。

MSCs可以自體取材，易于體外擴增，基因工程改造后可以自體回輸，不存在免疫排斥。這對將來應用于臨床具有重要意義。我們的研究顯示，MSCs易于接受由AAV或LV介導的外源基因?qū)?，LV介導的基因感染效率達91.4%。表明MSCs易于整合外源基因，是疾病基因治療中非常理想的運載細胞。

基因轉(zhuǎn)染的方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、氯化鈣轉(zhuǎn)染法、電穿孔法以及逆轉(zhuǎn)錄病毒介導法、腺病毒介導、腺相關病毒介導等，各有利弊。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體最為常用。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期細胞，容納外源基因的DNA片段長度不超過8 kb。腺病毒載體感染細胞時，病毒DNA游離在細胞核內(nèi)，并不整合到染色體上，在體內(nèi)不能實現(xiàn)穩(wěn)定的長期表達，反復應用易引起免疫反應[11]。

AAV是一種復制缺陷型病毒，傳統(tǒng)上需要輔助腺病毒或皰疹病毒共轉(zhuǎn)染[12-13]。本研究采用AAV helper-free系統(tǒng)，該系統(tǒng)以pHelper質(zhì)粒與HEK293細胞提供的基因產(chǎn)物替代腺病毒，以pAAV-RC提供rep與cap基因(兩者分別編碼病毒的復制信號與殼蛋白)，pAAV-MCS攜帶反向末端重復序列(Inverted terminal repeats,ITRs)。我們將目的基因LacZ構建在質(zhì)粒pAAV-MCS上，將重組pAAV-LacZ、pHelper和pAAV-RC質(zhì)粒一次共轉(zhuǎn)染包裝細胞，生產(chǎn)具有感染能力的AAV病毒顆粒。由于載體和輔助序列之間缺乏同源性，因此通過這種方式生產(chǎn)的AAV病毒不含野生型AAV病毒的污染。并且重組AAV病毒可以整合到19號染色體中，能夠長期表達目的基因。我們的研究結果顯示，磷酸鈣沉淀法對于HEK293細胞的轉(zhuǎn)染效果較好，由此包裝產(chǎn)生的病毒顆粒無需濃縮，病毒滴度即可達到107/ml。重組病毒顆粒再次感染MSCs的效率也較高，可轉(zhuǎn)染約一半的細胞。

人類免疫缺陷病毒21(HIV21)來源的LV載體越來越受到人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)，LV載體最大的特點是可以感染非分裂期細胞。目前已成功應用LV載體感染了神經(jīng)細胞、肝細胞、造血干細胞、胰島細胞、肌肉細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞、氣道上皮細胞等。此外，LV載體容納外源性目的基因的片段大，可以在體內(nèi)較長期表達，免疫反應小，安全性較好[14-16]。我們的實驗結果顯示，LV載體攜帶的GFP基因可在MSCs細胞內(nèi)高效表達，感染效率達91%。而且因為有Marker蛋白GFP的指示，非常便于觀察目的基因的表達情況。

綜上，AAV是基因治療中一種安全有效的基因轉(zhuǎn)染方法，尤其適合于長期基因表達。而LV更適合于目的片段比較大的基因，尤其適合于感染非分裂細胞如神經(jīng)元。

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Efficiency of Gene Transfection with Adeno-associated Viral Vector or Lentiviral Vector in Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells

SU Yu-jin,ZHAO Yu-mei,GU Yi.Beijing Neurosurgical Institute,Tiantan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China

ObjectiveTo compare 2 kinds of commonly used viral vectors,adeno-associated viral(AAV)vector and lentiviral(LV)vector in the gene transfection for bone marrow derived mesenchymal stem cells(MSCs).MethodsMSCs were isolated with density gradient (lymphocytes seperation)and identified with HE staining and immunocytochemistory staining for Nestin.The proliferation of BMSCs was detected with BrdU labeling.AAV mediated gene transfection was carried out through recombinant AAV-LacZ viral particles.For LV mediated gene transfection,the LV particles were used directly.The transfection efficiency was estimated with β-gal staining and green fluorescent protein under the fluorescent microscope respectively.ResultsMSCs was successfully isolated from the bone marrow.HE staining showed that MSCs was with big nucleus,1-3 nucleoli,and high nucleocytoplasmic ratio.BrdU labeling suggested that MSCs were proliferating.Some MSCs expressed Nestin.The gene transfection efficiency mediated with AAV vector was 49.1%,and it was 91.4%with LV vector(P＜0.01).ConclusionThe LV vector is more efficient on gene transfection thanAAV vector.

gene transfection;adeno-associated viral vector;lentiviral vector;mesenchymal stem cells

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.12.005

R394.8

A

1006-9771(2014)12-1117-05

2013-12-10

2014-01-21)

國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項資助項目(No.2012ZX09401004)。

北京市神經(jīng)外科研究所，首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院，北京市100050。作者簡介：蘇玉金(1978-)，男，漢族，北京市人，主管技師，主要研究方向：神經(jīng)病理學。通訊作者：顧漪(1981-)，女，漢族，江蘇常州市人，碩士，助理研究員，主要研究方向：神經(jīng)藥理學。E-mail:yjs403@126.com。