秦海軍，張 毅，馬 玲，陳師農(nóng)，任燕茹

（1.安徽省藥物研究所，安徽 合肥230022；2.安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230022；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230031）

中藥復(fù)方祛風(fēng)勝濕顆粒是根據(jù)著名經(jīng)方“羌活勝濕湯”研制而成，處方中含有羌活、獨(dú)活、防風(fēng)、川芎、藁本、蔓荊子和炙甘草7味藥，主治風(fēng)濕在表、肩背痛不可回顧、頭痛身重、腰脊疼痛、難以轉(zhuǎn)側(cè)、苔白脈浮。方中以羌活、獨(dú)活為君，羌活入太陽經(jīng)，能祛上部風(fēng)濕，獨(dú)活善祛下部風(fēng)濕，二者相合，能散周身風(fēng)濕，舒利關(guān)節(jié)而痛痹；以防風(fēng)、藁本為臣，祛太陽經(jīng)風(fēng)濕，且止頭痛；佐以川芎活血，祛風(fēng)止痛；蔓荊子祛風(fēng)止痛；佐以甘草調(diào)和諸藥。綜合全方，共成祛風(fēng)勝濕之功，服后當(dāng)微發(fā)其汗，使風(fēng)濕盡去，其痛即止。本研究中將方中羌活、獨(dú)活進(jìn)行醇提，考察了醇提時(shí)不同加醇量、回流時(shí)間、回流次數(shù)對(duì)浸膏得率及異歐前胡素含量的影響；防風(fēng)等藥材采用單因素試驗(yàn)，考察了加水量、提油時(shí)間對(duì)揮發(fā)油量的影響；將甘草與醇提藥渣及提油藥渣進(jìn)行水提，考察了水提時(shí)不同加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)對(duì)浸膏得率及甘草酸單銨鹽含量的影響，得出了祛風(fēng)勝濕顆粒穩(wěn)定可行的提取工藝。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC－10ATvp型高效液相色譜儀（單元泵，SPD－10Avp檢測(cè)器，LC－色譜工作站）；天津奧特塞斯AT－130型柱溫箱；AR1140型電子天平。異歐前胡素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110827－201109，含量測(cè)定用）；甘草酸單銨鹽對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110731－201116，含量測(cè)定用）；甲醇、乙腈為色譜純），水為重蒸水，其他試劑均為分析純。藥材均購自合肥市樂家老鋪中藥飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 羌活、獨(dú)活提取工藝研究

2.1.1乙醇濃度考察

羌活是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高、市場(chǎng)缺口較大的名貴中草藥，含有揮發(fā)油、香豆素類及糖類等成分，具有祛風(fēng)、散寒、除濕、止痛的藥效，臨床多用于治療感冒風(fēng)寒、頭痛無汗、風(fēng)寒濕痹、項(xiàng)強(qiáng)筋急、骨節(jié)酸疼等；獨(dú)活的主要成分包括香豆素類、揮發(fā)油類及少量甾醇和糖類，主要用于治療風(fēng)寒濕痹、腰膝疼痛、少陰伏風(fēng)頭痛、齒痛等癥[1－2]。根據(jù)其理化性質(zhì)和藥理、臨床應(yīng)用情況分析，在醇中溶解度優(yōu)于在水中溶解度，在生產(chǎn)中常用不同濃度乙醇為提取溶劑進(jìn)行提取，因此采用乙醇回流提取羌活、獨(dú)活中有效成分。按處方量配比稱取羌活和獨(dú)活藥材，4份，分別加10倍量不同濃度的乙醇回流2次，每次2h，提取液合并，濾過，回收乙醇至無醇味，濃縮，置已干燥的容器中，減壓干燥后，稱重，計(jì)算干浸膏得率，并以干膏量、干膏得率和干膏中異歐前胡素總量為指標(biāo)優(yōu)選乙醇濃度，結(jié)果見表1?？梢?，隨著乙醇濃度增加，干膏量逐漸減小，異歐前胡素總量在70%和80%時(shí)變化不大，在60%以下時(shí)相對(duì)較少。醇回流的目的是在盡量降低稠膏量的情況下，最大程度的保留有效成分，考慮到大生產(chǎn)的條件以及成本因素，用70%乙醇回流較合適。

表1 不同濃度乙醇提取試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇加醇量（因素A）、回流時(shí)間（因素B）和回流次數(shù)（因素C）作為考察因素，以提得的干浸膏中異歐前胡素總量和干浸膏量為考察指標(biāo)，選擇L9（3）4正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平表，見表2。

表2 醇提正交試驗(yàn)因素水平表

2.1.3試驗(yàn)方法

按處方量配比稱取羌活、獨(dú)活藥材9份，按下述正交試驗(yàn)表，加入70%乙醇，依試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定的條件進(jìn)行回流提取，合并提取液，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，濃縮，置已干燥的容器中，減壓干燥后稱重，計(jì)算干浸膏量并測(cè)定異歐前胡素總量。結(jié)果及分析見表3至表5。

2.1.4指標(biāo)測(cè)定方法[3－6]

色譜條件：色譜柱為Cosmosil5C18－MS－Ⅱ柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈－水（58:42），檢測(cè)波長(zhǎng)為310nm，柱溫為25℃，流量為1.0mL/min，理論板數(shù)按異歐前胡素計(jì)應(yīng)不低于4000。

表3 醇提工藝優(yōu)選正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 干膏得率與異歐前胡素含量方差分析

表5 醇提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

溶液制備：精密稱取異歐前胡素對(duì)照品，加甲醇分別制成每1mL含異歐前胡素0.036mg的溶液，搖勻，即得對(duì)照品溶液。取樣品研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50mL，密塞，精密稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250W，頻率25kHz）30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，備用，即得供試品溶液。

測(cè)定方法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定，即得。結(jié)果表明，樣品中異歐前胡素色譜峰分離度好，色譜圖見圖1。

2.1.5試驗(yàn)結(jié)果分析

以干膏得率為考察指標(biāo)時(shí)，由表3中極差R值可見，各因素作用主次為C＞A＞B；方差分析結(jié)果表明C因素有顯著影響，A因素和B因素?zé)o顯著影響，因此以A3B3C3為佳條件。以異歐前胡素量為考察指標(biāo)時(shí)，由表3中極差R值可見，各因素作用主次為A＞C＞B；方差分析結(jié)果表明，A因素和C因素有顯著影響，B因素?zé)o顯著影響，以A2B2C2為佳條件?？紤]到異歐前胡素含量較為重要，為了降低稠膏量，保證有效成分以及從大工業(yè)生產(chǎn)和節(jié)能降耗等全面綜合考察，選擇最佳醇提工藝條件為A2B2C2，即10倍量70%乙醇回流提取2次，每次2h為最佳醇提工藝條件。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.6醇提工藝優(yōu)選驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方量配比稱取羌活、獨(dú)活藥材3份，分別加入10倍量70%乙醇，按優(yōu)選的醇提工藝進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表5?？梢?，此提取工藝穩(wěn)定可行。

2.2 防風(fēng)等藥材揮發(fā)油提取工藝研究

2.2.1揮發(fā)油提取時(shí)間、加水量考察

按處方量配比稱取防風(fēng)、川芎、藁本和蔓荊子4味藥材3份，置揮發(fā)油提取器中，分別加入規(guī)定倍量水（見表6），浸泡至透心，按2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄揮發(fā)油測(cè)定法提取揮發(fā)油，從水微沸開始記錄不同提取時(shí)間所得揮發(fā)油量（mL），至油量不再增加，停止加熱，考察不同提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油量的影響。結(jié)果表明，提取時(shí)間為4h、加水量為8倍量時(shí)，揮發(fā)油總量最高，出油率最高。因此，優(yōu)選的揮發(fā)油提取最佳工藝為加8倍量水，提油4h。

表6 防風(fēng)等揮發(fā)油提取時(shí)間的選擇

2.2.2揮發(fā)油提取驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方量配比稱取防風(fēng)、川芎、藁本和蔓荊子4味藥材3份，加8倍量水，用揮發(fā)油提取器分別提取揮發(fā)油，提取4h，記錄揮發(fā)油量。結(jié)果3次試驗(yàn)分別提取揮發(fā)油1.5，1.4，1.3mL，平均1.47mL，表明揮發(fā)油提取4h較完全，且揮發(fā)油得率較穩(wěn)定。

2.3 水提取工藝研究

2.3.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

甘草主要為黃酮及皂苷類成分，有緩急止痛、調(diào)和諸藥之功效[7－8]。為有效的控制本品質(zhì)量，選擇甘草的有效成分甘草酸單銨鹽的作為含量測(cè)定指標(biāo)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選定加水量（因素A）、煎煮時(shí)間（因素B）和煎煮次數(shù)（因素C）作為考察因素，以提得的甘草中甘草酸單銨鹽量和干浸膏量為考察指標(biāo)，選擇了L9（3）4正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平表見表7。

表7 水提取工藝優(yōu)選試驗(yàn)因素水平表

2.3.2試驗(yàn)方法

按處方量配比稱取甘草藥材9份，分別和其他按處方量配比稱取的藥材醇提及提油后的藥渣，合并，按正交試驗(yàn)安排依次進(jìn)行提取，提取液合并，濾過，濾液濃縮，置已干燥的容器中，減壓干燥后稱重，計(jì)算干浸膏量并測(cè)定甘草酸單銨鹽的量，結(jié)果及分析見表8至表9。

表8 水提取工藝優(yōu)選正交試驗(yàn)表

表9 干膏得率及甘草酸單銨鹽方差分析

2.3.3指標(biāo)含量測(cè)定方法[9－11]

色譜條件：色譜柱為Cosmosil5C18－MS－Ⅱ柱（250mm×4.6ID，5μm），流動(dòng)相為乙腈－2%冰醋酸（40:60），檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，柱溫為25℃，流速為1.0mL/min，理論板數(shù)按甘草酸單銨鹽峰計(jì)應(yīng)不低于2000。

溶液制備：取甘草酸單銨鹽對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1mL含75.7μg的溶液，搖勻，即得對(duì)照品溶液。取樣品研細(xì)，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加流動(dòng)相25mL，密塞，精密定重量，超聲處理（功率250W，頻率25kHz）30min，放冷，再稱定重量，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，備用，即得供試品溶液。

測(cè)定方法：分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。結(jié)果表明，樣品中甘草酸單銨鹽色譜峰分離度好，色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2.3.4試驗(yàn)結(jié)果分析

以干膏得率為考察指標(biāo)時(shí)，由表3中極差R值可見，各因素作用主次為C＞B＞A；方差分析結(jié)果表明，C因素有顯著影響，A因素和B因素?zé)o顯著影響，以A3B3C3為佳。以甘草酸單銨鹽為考察指標(biāo)時(shí)，由表3中極差R值可見，各因素作用主次為C＞A＞B；方差分析結(jié)果表明，C因素有顯著影響，A因素和B因素?zé)o顯著影響，以A3B2C2為佳?？紤]到甘草酸單銨鹽含量較為重要，為降低稠膏量，保證有效成分以及從大工業(yè)生產(chǎn)和節(jié)能降耗等全面綜合考察，選擇最佳水提工藝條件為A3B2C2，即10倍量水煎煮2次，每次1h為最佳水提工藝條件。

2.3.5水提取工藝優(yōu)選驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方量配比稱取甘草等7味藥材3份，按優(yōu)選的工藝進(jìn)行醇提和提油后，藥渣與甘草藥材加10倍量水煎煮2次每次1h，以提得的甘草中甘草酸單銨鹽量和干浸膏量為考察指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見表10?？梢姡颂崛」に嚪€(wěn)定可行，故確定為最佳提取工藝條件。

表10 水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

本方為經(jīng)典古方，療效確切，臨床使用時(shí)多為湯劑，使用和攜帶不方便，固對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，制成適合臨床使用的顆粒劑，通過藥理試驗(yàn)表明，該顆粒具有一定的鎮(zhèn)痛、抗炎等作用。本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)的考察方法對(duì)祛風(fēng)勝濕顆粒的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化篩選，確定的最佳提取工藝路線穩(wěn)定可行，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。

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