摘 要：研究應用RNA干擾技術(shù)沉默人卵巢癌SW626細胞趨化因子受體4（CXCR4）基因后，卵巢癌細胞CXCR4的蛋白表達情況，對卵巢癌細胞增殖活性的影響。設計合成兩對針對CXCR4基因的siRNA片段，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至卵巢癌SW626細胞中，熒光顯微鏡觀察檢測轉(zhuǎn)染效率，采用Western blot檢測RNA干擾后卵巢癌SW626細胞CXCR4蛋白的表達情況。利用四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法檢測轉(zhuǎn)染前后細胞增殖的情況。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后，卵巢癌SW626細胞CXCR4/β-actin蛋白表達水平降低（P<0.05），卵巢癌SW626細胞的增殖受到明顯抑制（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：RNA干擾；卵巢癌；CXCR4基因

RNA干擾（RNAi）技術(shù)是最近幾年發(fā)展起來的一種阻斷基因表達的新方法，是由雙鏈RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制，具有效率高、特異性高、顯效快、可以向子代遺傳和同時進行多基因研究等特點，可望成為腫瘤基因治療的新手段。

卵巢腫瘤是女性生殖器常見腫瘤，其中卵巢上皮性癌約占卵巢惡性腫瘤的90%。卵巢惡性腫瘤的5年生存率仍然較低，僅僅只有25%-30%[1]。

本研究利用可在細胞內(nèi)自主生成siRNA的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞株SW626，觀察其對CXCR4蛋白表達的影響，及對卵巢癌細胞增殖的影響。

【中圖分類號】R737.31 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-8602（2014）06-0012-02

1 材料與方法

1.1 材料

卵巢癌細胞株SW626購自南京凱基公司，設計合成兩對針對CXCR4基因的siRNA片段及陰性對

照siRNA均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，DMEM高塘培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibaco公司，Lipofectamine TM 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

SW626細胞由DEMN高糖培養(yǎng)基（含10%的進口胎牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉索100μg/ml，pH值調(diào)至7.2-7.4）在37℃、5%CO2 的孵箱中培養(yǎng)。試驗用細胞均處于對數(shù)生長期。試驗分為空白對照組（脂質(zhì)體+轉(zhuǎn)染液）、陰性對照組（脂質(zhì)體+轉(zhuǎn)染液+陰性siRNA）、Sl組（脂質(zhì)體+轉(zhuǎn)染液+ siRNA1）、S2組（脂質(zhì)體+轉(zhuǎn)染液+ siRNA2）。

1.3 轉(zhuǎn)染方法

采用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染，按Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑的說明書進行細胞轉(zhuǎn)染。正式轉(zhuǎn)染前，先優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，按不同比例的質(zhì)粒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SW626細胞，取效果最佳者。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)最佳轉(zhuǎn)染條件為質(zhì)粒和脂質(zhì)體比例為1：3。

1.4 Western blot檢測CXCR4蛋白的表達

轉(zhuǎn)染48h后收集細胞，加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，制備10% SDS-PAGE凝膠，每孔上樣50ug，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，依次與CXCR4抗體（1：500）及辣根過氧化物酶標記的二抗反應，化學發(fā)光法曝光顯影，沖洗膠片，用紫外分光光度計掃描條帶灰度值，β-actin作為內(nèi)參，計算蛋白質(zhì)表達水平。

1.5 MTT法檢測siRNA-CXCR4沉默后對卵巢癌細胞增殖活性的影響

取對數(shù)生長期細胞，細胞密度調(diào)整為5×104 /ml，每組設3個平行孔，分別于轉(zhuǎn)染24h、48h、72 h后每孔加入MTT 20μl，孵育4h后加入二甲亞砜（DMSO）150μl，選擇570nm波長，用自動酶標儀檢測各孔吸光值。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SAS8.1統(tǒng)計軟件包，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA干擾對SW626細胞CXCR4蛋白表達的影響

通過RNA干擾48h后，采用Western blot檢測各組細胞中CXCR4蛋白的表達，結(jié)果顯示：①實驗組與空白對照組、陰性對照組比較：實驗組CXCR4/β-actin蛋白表達水平顯著受抑制（74.7%7.4% vs 21.4%7.8%， P<0.05； 74.7%7.4% vs 21.1%4.4%， P<0.05； 57.1%9.7% vs 21.4%7.8%， P<0.05； 57.1%9.7% vs 21.1%4.4%， P<0.05）。②陰性對照組和空白對照組比較：無顯著性差異。③實驗組Sl組和S2組比較：無顯著性差異。實驗結(jié)果說明，轉(zhuǎn)染siRNA后，CXCR4基因的表達被明顯抑制。

1：空白對照組，2：陰性對照組，3：實驗組S1組，4：實驗組S2組

Western blot 檢測各組細胞中CXCR4蛋白的表達

2.2 MTT檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖情況

細胞抑制率（%）=[（對照組A值-實驗組A值）/ 對照組A值]×100%

隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，空白對照組和陰性對照組比較差異無顯著性意義（P>0.05）。實驗組與空白對照組、陰性對照組比較，各時間段差異均有顯著性意義（P<0.05）。實驗組S1組和S2組比較差異無顯著性意義（P>0.05）。說明siRNA對SW626細胞的增殖有明顯的抑制作用。

3 討論

CXCR4基因定位于染色體2q21[3]。正常情況下CXCR4基因不會引起腫瘤。CXCR4主要功能性表達細胞為嗜中性粒細胞、單核-巨噬細胞系統(tǒng)。CXCR4不僅具有使腫瘤細胞趨化和牽引的作用，還可以使細胞骨架蛋白發(fā)生重排，形成明顯的偽足，增強細胞的運動性 。還有研究發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4可以上調(diào)腫瘤細胞表達基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9，減少其抑制因子的分泌，從而使細胞外基質(zhì)發(fā)生降解，以促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[6-9] 。Bonavia[10]等研究還發(fā)現(xiàn) SDF-1/CXCR4可以刺激高表達CXCR4的腫瘤細胞的增殖及存活，保護細胞由于血清饑餓而導致的細胞凋亡。2001年，Muller首先報道CXCR4在人類乳腺癌中高表達，而CXCR4的特異性配體SDF-1在乳腺癌容易發(fā)生轉(zhuǎn)移的器官中高表達，如果用抗體中和CXCR4，可以導致乳腺癌器官特異性轉(zhuǎn)移潛能的明顯下降。近年來研究發(fā)現(xiàn)趨化因子SDF-1/CXCR4生物學軸在卵巢癌細胞中表達，并介導卵巢癌細胞及血管內(nèi)皮細胞的遷移，在卵巢癌生長、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。

siRNA介導的RNA干擾技術(shù)是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS），為哺乳動物基因功能的研究提供了強大的工具。RNA干擾可以完全下調(diào)特定蛋白的表達能力，是基因功能研究的重要方法。

本實驗中，我們通過RNA干擾，使目的基因CXCR4基因沉默，從而進一步研究CXCR4基因的功能以及其在卵巢癌細胞中的表達及其對卵巢癌細胞生物學行為的影響。在本實驗中，我們針對CXCR4基因設計了兩條RNA干擾序列，并經(jīng)BLAST查詢對比無同源基因，化學合成兩條特異的siRNA，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至卵巢癌細胞中，第二天在顯微鏡下觀察，實驗S1組和S2組細胞形態(tài)不佳，折光性變差，并隨時間的推移，活細胞數(shù)明顯減少，大量死細胞懸浮；在熒光顯微鏡下觀察，實驗組的細胞體積縮小、細胞皺縮、細胞解離成彼此黏附成團的圓形小體-凋亡小體，說明轉(zhuǎn)染siRNA后，卵巢癌細胞的凋亡增加進而引發(fā)細胞的生長受抑制，而空白對照組和陰性對照組細胞形態(tài)和生長速度正常。Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染siRNA組與空白對照組和陰性對照組相比，CXCR4蛋白表達降低。本實驗還運用MTT法檢測轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h卵巢癌細胞的存活率，計算出細胞的增殖抑制率，實驗結(jié)果顯示干擾組細胞增殖抑制率24h、48h、72h分別為33.23%和30.21%、33.39%和29.68%、27.68%和30.46%，明顯高于陰性對照組。這些結(jié)果表明RNA干擾CXCR4基因后卵巢癌細胞的增殖受到明顯抑制，抑制CXCR4基因可以減緩腫瘤的生長，因此，CXCR4基因有可能成為卵巢癌基因治療的靶基因，為卵巢癌治療提供了一個新的選擇。但是，本研究僅僅是初步探討，只實驗了一個卵巢癌細胞系，且只是體外實驗，尚需要進一步擴展到其他的卵巢癌細胞系，并進行體內(nèi)實驗，以取得更多的實驗數(shù)據(jù)，以更好的找到對卵巢癌的治療方法。

參考文獻

[1] 魯艷明，張淑蘭，趙彥艷. HRE-2基因沉默對卵巢癌細胞體外增殖能力的影響[J].中華腫瘤防治雜志.2006，13（22）：1689-1693.

[2] 林遠洪，吳永忠，黃環(huán)，等.RNAi沉默EGFR基因在卵巢癌裸鼠移植瘤的成瘤抑制作用[J].重慶醫(yī)科大學學報.2009，34（3）：265-268.

[3] 劉思源，張玉想，楊勁松.RNA干擾PPO基因抑制卵巢癌細胞生長[J].中國腫瘤臨床.2006，33（21）：1210-1213.