摘要： 目的：研究探討EGCG對惡性膠質瘤細胞凋亡過程的影響作用，探討EGCG抗惡性膠質瘤細胞的可能機制。方法：MTT法檢測EGCG處理惡性膠質瘤細胞后的活性及流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果：與對照組相比，隨著用藥濃度增高，細胞生長抑制率逐漸增高，即細胞活性下降（P<0.05）。結論： EGCG抗惡性膠質瘤細胞的可能機制發(fā)生細胞凋亡，為抗惡性膠質瘤治療方面的臨床用藥奠定基礎。

關鍵詞：EGCG；惡性膠質瘤；細胞凋亡。

多形性膠質母細胞瘤（GBM）是常見的中樞神經系統(tǒng)惡性神經上皮細胞腫瘤，占膠質瘤的25%以上，也是100種腦癌類型中最兇險的惡性腦癌[1]。手術切除后常很快復發(fā)，預后極差，盡管實行傳統(tǒng)手術，化學治療及輻射治療，但患者多在2年內死亡[2]。，故在治療上是一個世界性難題。近年來，植物來源藥物越來越受到重視，充分利用我國藥用植物資源，開發(fā)新的抗腫瘤藥物，已成為腫瘤研究領域的重要內容?，F代研究表明， 茶多酚具有抗腫瘤，抗氧化，抗炎效應。同時也能抑制多種細胞黏附分子、TNF、COX-2和MMP-9的表達[3]。因此， 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是一類非常有前途的抗腫瘤藥物[2]。本實驗我們進行了EGCG誘導惡性膠質瘤細胞凋亡的研究，現報告如下：

【中圖分類號】R651 【文獻標識碼】B 【文章編號】1672-8602（2014）06-0003-02

1 材料與方法

1. 1 材料 高糖型DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；新生小牛血清購自杭州四季青公司；DMSO、MTT均為Sigma公司產品。處理細胞時，DMSO的最終體積小于或等于0.1%。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取惡性膠質瘤細胞U87MG傳代30～36h處于對數生長期的細胞（約70%～80%融合），以每孔0.5×105細胞平均接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔體積1ml，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁供實驗用。

1.2.2 與EGCG共孵育 去除含原培養(yǎng)液，用不含血清的培養(yǎng)液洗3次后，加入等量的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，同時按實驗要求加入不同濃度（0.1、10、15、20μM）的EGCG，另每孔加100ng/ml 的PMA。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48h后，收集細胞和上清液。

1.2.3 MTT 法 細胞種植于24孔培養(yǎng)板，生長至80%融合，EGCG濃度梯度組（5%、10%、15%）處理，24h后加入終濃度為0.5g/L的MTT溶液，繼續(xù)37℃孵育4h；酶標儀測定在570nm波長處吸光度值。用以下公式計算細胞生長抑制率。抑制率（%）=100%×（對照組吸光度值均值-實驗組吸光度值均值）/對照組吸光度值均值。

1.2.4 流式細胞儀分析 繼續(xù)孵育24h后，收獲細胞，制成單細胞懸液，700g離心5min，棄上清，冷PBS洗滌后，用-20℃預冷的70%乙醇于4℃固定24h。分析前調整細胞濃度為106/mL，取1mL細胞懸液，用PBS洗三次，加入RNase于37℃作用30min，再加入PI染液37℃避光染色30min，即可進行流式分析[3]。

1.2.5 統(tǒng)計分析 結果以x±s表示，n為樣本數，用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件分析。P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學顯著性。

2 結果

2.1 MTT 法測定細胞活性變化

U87MG細胞株與EGCG共孵育24h 后，與對照組相比，隨著用藥濃度增高，細胞生長抑制率逐漸增高，即細胞活性下降（P<0.01），可見EGCG呈濃度依賴性抑制胃U87MG細胞株生長。見表1 。

2.2 流式細胞儀分析

如表2所示，U87MG細胞株與EGCG共孵育24h后，隨著用藥濃度增高，細胞凋亡率與對照組相比，顯著增加；細胞周期分析結果顯示，20μM EGCG處理U87MG細胞24h后，G2/M期細胞百分率比對照組升高了3倍。

3 討論

真核多細胞生物的細胞數目是通過細胞的增殖和死亡二者的平衡來維持的，而維持這種平衡的因素之一的“死亡”在很大程度上是通過凋亡來實現的。腫瘤實際上也是一種凋亡異常的疾病，本該發(fā)生凋亡的細胞未發(fā)生凋亡是腫瘤發(fā)生的機制之一[4]。目前研究發(fā)現許多化學藥物和放射治療方法都是通過誘導細胞凋亡發(fā)揮其抗癌作用的[5]。常規(guī)的化學藥品治療費用昂貴且具有嚴重的毒副作用。為克服這些缺點和不足，許多學者正在積 極尋找開發(fā)中藥來源的新型抗癌藥物。

本實驗以MTT法檢測觀察EGCG對惡性膠質瘤細胞U87MG細胞，結果表明，EGCG對惡性膠質瘤細胞U87MG細胞有明顯抑制作用，不同濃度EGCG對惡性膠質瘤細胞細胞增殖呈現出不同程度的抑制作用，呈現明顯的劑量依賴關系。

細胞周期的阻滯與細胞凋亡、分化關系密切。細胞周期能夠順利發(fā)生、發(fā)展和完成， 取決于重要控制點。隨著細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展，本研究中經終濃度為20μMEGCG處理U87MG細胞24h后，G2/M期細胞百分率比對照組升高了3倍。

說明較高濃度EGCG可誘導惡性膠質瘤細胞U87MG細胞發(fā)生顯著的G2/M期阻滯

參考文獻

「1」 Glas M， Rath BH， Simon M，. et al. Residual tumor cells are unique cellular targets in glioblastoma.. Ann Neurol. 2010，68（2）：264-269..

「2」 Dang L， Jin S， Su SM. IDH mutations in glioma and acute myeloid leukemia.. Trends Mol Med. 2010，16（9）：387-397..

「3」 Enloe BM， Jay DG. Inhibition of Necl-5 （CD155/PVR） reduces glioblastoma dispersal and decreases MMP-2 expression and activity. J Neurooncol. 2010.

「4」 Raizer JJ， Grimm S， Chamberlain MC， et al. A phase 2 trial of single-agent bevacizumab given in an every-3-week schedule for patients with recurrent high-grade gliomas.. Cancer. 2010