摘要：孔雀石綠是三個(gè)芳香胺的聚合物，具有潛在的致癌、致畸、致突變作用，國家已經(jīng)禁止孔雀石綠在食用水產(chǎn)品中應(yīng)用，但現(xiàn)實(shí)當(dāng)中還存在非法使用的現(xiàn)象。本文在GB/T20361-2006標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了水產(chǎn)品中孔雀石綠的前處理方法。

結(jié)果表明本文所優(yōu)化的水產(chǎn)品樣品前處理方法時(shí)間比GB/T20361-2006減少近一半，大大減少乙腈和二氯甲烷的用量，不需使用容易交叉污染的勻漿機(jī)和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，分析結(jié)果回收率高，重復(fù)性好。

關(guān)鍵詞：孔雀石綠 高效液相色譜（熒光檢測器） 水產(chǎn)品

中圖分類號(hào)：S948 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2014）04-0025-02

目前分析水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠殘留的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法中，從需要的儀器設(shè)備條件和檢測限要求角度，采用熒光檢測器的液相色譜方法GB/T20361-2006可在基層檢測部門得到應(yīng)用，且可滿足對歐盟及日本出口檢測限的要求。

為此，本論文針對GB/T20361-2006方法在實(shí)際應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)的問題，進(jìn)行優(yōu)化研究，減少樣品前處理步驟和提高孔雀石綠還原率，從而達(dá)到縮短樣品前處理時(shí)間、提高回收率的目的。

GB/T20361-2006方法的樣品前處理過程中，樣品要經(jīng)歷4次采用乙腈提取結(jié)合4次離心獲得目標(biāo)物提取液，期間要采用2次硼氫化鉀的還原處理，提取液接著再要經(jīng)歷2次采用二氯甲烷萃取，接著蒸發(fā)濃縮提取液，再經(jīng)酸性氧化鋁和PRS小柱凈化，才獲得樣液上機(jī)分析，提取步驟多，成本高，容易造成交叉污染，回收率低。針對以上發(fā)現(xiàn)的問題，我們對GB/T20361-2006的方法進(jìn)行了改進(jìn)。

1 水產(chǎn)品中孔雀石綠檢測材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備和試劑

1.1.1 儀器設(shè)備

電子分析天平（感量0.00001g），德國賽多利斯（CP225D）；電子天平（感量0.01g），德國賽多利斯（BS2202S）；高速冷凍離心機(jī)；酸度計(jì)，氮吹儀；超聲波清洗機(jī)；渦旋混合器；固相萃取裝置，美國sepelco（12-port）；溶劑過濾器；高效液相色譜（帶RF-10Axl熒光檢測器）。

1.1.2 試劑

乙腈-色譜純；甲醇-色譜純；二氯甲烷-色譜純；無水乙酸銨-分析純；冰乙酸-優(yōu)級(jí)純；硼氫化鉀-分析純；酸性氧化鋁-分析純（粒度80～100目）；氯化鈉-分析純；對-甲苯磺酸-分析純；鹽酸羥胺-分析純；氨水-分析純。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，Dr.Ehrenstorfer，純度98.5%，不確定度±1%；隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，Dr.Ehrenstorfer，純度92%，不確定度±1%。

1.1.4 其它耗材

PRS小柱，Varian，500mg，3mL；有機(jī)濾膜，天津津騰0.45m，直徑13mm；無機(jī)濾膜，天津津騰，0.22m，直徑45mm；一次性注射器，上海中鴿，2mL。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：島津ODS-C18柱250mm×4.6mm，粒度5μm；流動(dòng)相：乙腈+乙酸銨緩沖溶液（0.125mol/L，pH4.5）=75+25；流速：1.3mL/min；柱溫：35℃；

激發(fā)波長：265nm，發(fā)射波長：360nm；進(jìn)樣量：20mL

1.3 前處理方法

取草魚、三文魚、鳙魚、蝦肌肉組織均質(zhì)，準(zhǔn)確稱取5.00g于50mL有蓋離心管中，加入4mL乙腈，再加入5mL硼氫化鉀溶液，渦旋振蕩3min，放置15min，期間劇烈振蕩2～3次，每次1min。在離心管中繼續(xù)加入1.5mL鹽酸羥胺、1.5mL對-甲苯磺酸、5.0mL乙酸銨緩沖溶液（0.125mol/L）和4mL二氯甲烷，渦旋振蕩1min。在離心管中再加入7g酸性氧化鋁，3g氯化鈉，渦旋振蕩1min，6000rpm離心5min，收集上層溶液。下層再加入5mL二氯甲烷，劇烈振蕩1min，6000rpm離心5min，合并二氯甲烷層，此步驟重復(fù)操作一次。合并后的二氯甲烷層加入10mL水，劇烈振蕩30s，6000rpm離心5min，棄去上層。

凈化：將PRS柱安裝在固相萃取裝置上，先用5mL乙腈分兩次活化柱子，轉(zhuǎn)移上述提取液在PRS柱上過柱，用3mL甲醇水溶液洗柱，吹干固相萃取柱，再用 3.0mL等體積混合的乙腈和乙酸銨溶液（0.1mol/L）洗脫，收集洗脫液，乙腈定容到3mL，過0.45μm濾膜過濾，供液相色譜測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性判斷

本實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)峰能與其它雜質(zhì)峰完全分離，峰形較好。在上述色譜條件下，對標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定，以保留時(shí)間作為該物質(zhì)的定性判斷標(biāo)準(zhǔn)。隱性孔雀石綠的保留時(shí)間為15.2min。

2.2 定量計(jì)算

樣品中孔雀石綠的殘留量按式（2.2.4.2）計(jì)算。

（2.2.4.2）

式中：X——樣品中待測組分殘留量，單位為毫克每公斤（mg/kg）；

Cs——待測組分標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

A——樣品中待測組分的峰面積；

As——待測組分標(biāo)準(zhǔn)工作液的峰面積；

V——樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）；

m——樣品質(zhì)量，單位為克（g）。

2.3 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍及相關(guān)性

用孔雀石綠中間液配成標(biāo)準(zhǔn)的工作曲線濃度系列為0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。以峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，做一標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出相關(guān)系數(shù)和線性范圍。曲線方程為：F（x）=5.82307e-005*x+0.357053，相關(guān)系數(shù)為：0.9998。孔雀石綠在0.5～100ng/mL范圍內(nèi)有很好的線性。

2.4 水產(chǎn)品中的孔雀石綠檢出限（LOD）

以陰性魚肉樣品稀釋成0.5μg/kg的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)前處理分析測定信噪比（S/N）比為9.289。本方法魚肉中孔雀石綠理論檢出限為0.161g/kg，但在此加標(biāo)濃度下，其回收率偏差大，重復(fù)性差，從實(shí)驗(yàn)精密度和準(zhǔn)確度以及儀器靈敏度等方面考慮，本方法在空白樣品中添加0.5g/kg孔雀石綠時(shí)，其回收率≥70%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%，具有較好的可靠性。因此將0.5mg/kg定為本方法的檢出限。

2.5 魚肉中孔雀石綠的加標(biāo)回收率和變異系數(shù)（n=6）

準(zhǔn)確稱取三文魚樣品（空白樣品）5.00g，分別加入濃度為0.1g/mL的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液25L、50L和250L，混勻，靜置30min，按上述前處理方法和檢測方法來檢測。測得的回收率范圍在78.4%～100.2%，變異系數(shù)分別為4.88%、3.40%和2.77%。

3 討論

綜上所述，本研究探索改進(jìn)了水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測方法，預(yù)處理時(shí)間比GB/T20361-2006縮短50%，并解決了當(dāng)中所遇到的一些問題，試劑用量少，節(jié)省了大量的人力、物力成本，迎合了當(dāng)前水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留檢測的高通量篩選要求?？兹甘G在 0.5ng/mL～100ng/mL范圍有良好的線性，相關(guān)系數(shù)為0.9998，該方法測得的最低檢出限為0.5g/kg，回收率穩(wěn)定在70%～110%，標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%。