摘要：本快速測(cè)定方法使用甲醇提取液超聲波提取動(dòng)物源性制品中萊克多巴胺，采用樣品與抗體預(yù)混的間接非競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定樣品中的萊克多巴胺。沒(méi)有采用常規(guī)的間接競(jìng)爭(zhēng)法，而是預(yù)先混合抗體和待測(cè)物質(zhì)，使得檢出限底，達(dá)到0.0044ng/mL，其含量在0.0044～11ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9799，回收率在65%～89%之間，具有較好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和回收率，能滿足實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：ELISA 萊克多巴胺 間接非競(jìng)爭(zhēng)法 低檢出限

中圖分類號(hào)：S859.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2014）02-0015-06

1 材料與實(shí)驗(yàn)方法建立

1.1 試劑

萊克多巴胺人工偶聯(lián)牛血清白蛋白抗原（RAC-BSA），萊克多巴胺小鼠單克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠二抗，牛血清白蛋白（BSA），均由北京奧博森提供。磷酸二氫鉀，十二水合磷酸氫二鈉，氯化鈉，氯化鉀，碳酸鈉，碳酸氫鈉，一水合檸檬酸，吐溫-20，二甲基亞砜，30%雙氧水，硫酸，以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

試劑配制：

精確稱取氯化鈉4.0000g、十二水合磷酸氫二鈉 1.4500g、氯化鉀0.1000g和磷酸二氫鉀0.1000g，混合后用超純水溶解并定容至500mL，得到磷酸鹽緩沖液（PBS），該磷酸鹽緩沖液的pH值為7.4，磷酸鹽緩沖液過(guò)0.22μm微孔濾膜除菌，并保存在4℃下。

精確稱取碳酸鈉0.3975g和碳酸氫鈉0.7425g，混合后用超純水溶解并定容至500mL，得到碳酸鹽緩沖液（CBS），該碳酸鹽緩沖液的pH值為9.6，碳酸鹽緩沖液過(guò)0.22μm微孔濾膜除菌，并保存在4℃下。

精確稱取一水合檸檬酸2.5514g和十二水合磷酸氫二鈉9.1951g，混合后用超純水溶解并定容至500mL，得到底物緩沖液，該底物緩沖液的pH值為5.0，底物緩沖液過(guò)0.22μm微孔濾膜除菌，并保存在4℃下。

精確稱取牛血清白蛋白（BSA）1g，用PBS定容至100mL，得到BSA封閉液，BSA封閉液過(guò)0.22μm微孔濾膜除菌，并保存在4℃下。

取500ml PBS溶液，加入250μL吐溫-20，得到PBST洗液，PBST洗液過(guò)0.22μm微孔濾膜除菌，并保存在4℃下。

精確稱取3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB） 0.0100g，溶于2mL二甲基亞砜中，得到TMB底物液，TMB底物液過(guò)0.22μm微孔濾膜除菌，并保存在4℃下。

分別取質(zhì)量百分比濃度為10%的雙氧水溶液21μL、底物緩沖液10mL和TMB底物液200μL，臨用前混合，得到顯色液。

稱取98g濃硫酸，緩慢倒入200mL蒸餾水中，冷卻至室溫定容至500mL，得到2mol/L的硫酸終止液。

稱取氯化鈉2g，用蒸餾水溶解并定容至100mL，得到2%氯化鈉。

吸取濃鹽酸2mL，用蒸餾水溶解并定容至100mL，得到2%（V/V）鹽酸。

按體積比2%氯化鈉：2%鹽酸：甲醇=1：1：8混合，得到樣品酸性提取液。

1.2 儀器

恒溫干燥箱，酶標(biāo)儀，4℃冰箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法建立

（1）酶標(biāo)板吸附能力均一性檢測(cè)：見表1

若酶標(biāo)板每個(gè)孔內(nèi)活性位點(diǎn)不均勻，會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異，平行不好，所以首先檢查所使用的酶標(biāo)板的均一性。隨機(jī)選取六塊酶標(biāo)板，每塊酶標(biāo)板再隨機(jī)選擇四個(gè)酶標(biāo)孔，以CBS為緩沖液將抗原蛋白稀釋到2μg/mL，并加入到酶標(biāo)孔內(nèi)，每孔加入100μL，加蓋放入4℃冰箱孵育24h（以上步驟稱為包被），倒出孔內(nèi)液體，甩干，向每個(gè)酶標(biāo)孔內(nèi)加入300μLPBST洗滌液，震蕩搖勻，倒出孔內(nèi)液體，甩干，重復(fù)洗滌四次，拍干（以上步驟稱為洗板），拍干后向每個(gè)酶標(biāo)孔內(nèi)加入 300μLBSA封閉液，并放入37℃恒溫箱中孵育90min（該過(guò)程稱為封閉）；封閉結(jié)束后，重復(fù)洗板過(guò)程，以PBS緩沖液將抗體蛋白稀釋到1μg/mL，并加入到酶標(biāo)孔內(nèi)，每孔加入100μL，并放入37℃恒溫箱中孵育20min，反應(yīng)結(jié)束后重復(fù)洗板過(guò)程，以PBS為緩沖液將酶標(biāo)二抗稀釋到1μg/mL，并加入到酶標(biāo)孔內(nèi)，每孔加入100μL，并放入37℃恒溫箱中孵育20min，反應(yīng)結(jié)束后重復(fù)洗板過(guò)程，拍干后向孔內(nèi)加入顯色液100μL/孔，放入37℃恒溫箱中孵育15min，充分顯色。反應(yīng)結(jié)束后向孔內(nèi)加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)定為450nm，在5min之內(nèi)測(cè)定每孔的吸光值，同時(shí)作空白實(shí)驗(yàn)，以空白作參比；（整個(gè)過(guò)程稱為間接ELISA試驗(yàn)）。

根據(jù)吸光值可知其中一塊酶標(biāo)板不合實(shí)驗(yàn)要求，之后實(shí)驗(yàn)中不能使用。其他五塊酶標(biāo)板板間變異系數(shù)小于10%符合ELISA實(shí)驗(yàn)的要求。

（2）抗原抗體最佳反應(yīng)濃度選擇（棋盤試驗(yàn)）：見表2

用PBS緩沖液（pH=7.4）將抗原配制成0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL；用pH=7.4的PBS為緩沖液將抗體配制成1.67μg/mL、1.43μg/mL、1.25 μg/mL、1.11μg/mL、1μg/mL，用間接ELISA方法做各濃度的正交試驗(yàn)，并選出吸光值接近1.000對(duì)應(yīng)的的抗原-抗體濃度。

從上表可以看出，在抗原濃度為5μg/mL，抗體濃度為1.67μg/mL時(shí)吸光值為1.003，所以選擇抗原濃度為5μg/mL，抗體濃度為1.67μg/mL為最佳濃度。

（3）包被溫度及時(shí)間的選擇：見表3

選擇三種不同包被條件：4℃下包被24小時(shí)、37℃下包被3小時(shí)、4℃下包被12小時(shí)后37℃包被1.5小時(shí)，在三種條件下包被最適濃度抗原，并做間接ELISA實(shí)驗(yàn)，選出顯色較好的條件。

結(jié)果表明：三種方法無(wú)明顯差別，考慮操作方便，選用4℃下包被24小時(shí)的方法。

（4）包被緩沖液的選擇：見表4

以pH=9.6、pH=7.4、pH=5.2三種不同的緩沖液，在4℃下24小時(shí)條件下包被抗原，并做間接ELISA實(shí)驗(yàn)，選出顯色較好的條件。

結(jié)果表明：pH=5.2的緩沖溶液不適合該抗原包被，由于酸度過(guò)高，不能達(dá)到該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，包被效果不好，所以選擇pH=9.6的CBS緩沖溶液包被該抗原。

（5）封閉液選擇：見表5

用1%BSA、3%BSA、1%明膠、3%明膠、1%脫脂奶粉五種不同封閉液，封閉包被好的酶標(biāo)板，并做ELISA實(shí)驗(yàn)，選出板內(nèi)差異小的封閉液。

結(jié)果表明：1%BSA和3%BSA的封閉效果較好，明膠的重復(fù)性不好，脫脂奶粉顯色略高，且封閉后不易保存，所以選用1%BSA做封閉液。

（6）酶標(biāo)二抗反應(yīng)濃度的選擇：見表6、圖1

用PBS為緩沖液將酶標(biāo)二抗配制成0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、 4μg/mL并做間接ELISA實(shí)驗(yàn)，選擇吸光值在1.000附近的濃度。

結(jié)果表明：隨二抗?jié)舛鹊脑龃笪庵惦S之增大，在濃度1.00μg/mL時(shí)，吸光值增大的幅度很緩慢，說(shuō)明濃度為1.00μg/mL的二抗已經(jīng)可以和孔中的一抗充分結(jié)合，為了節(jié)約試劑，所以選擇1.00μg/mL作為二抗的最佳濃度。

（7）抗體反應(yīng)時(shí)間的選擇：見表7、圖2

分別選擇15min，30min，45min，60min，75min五個(gè)不同反應(yīng)時(shí)間，做ELISA實(shí)驗(yàn)。

一抗在30min時(shí)反應(yīng)完全，在30分鐘之后增加反應(yīng)時(shí)間，吸光值無(wú)明顯變化，所以選擇30min為反應(yīng)時(shí)間。

（8）酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間的選擇：見表8、圖3

分別選擇15min，30min，45min三個(gè)不同反應(yīng)時(shí)間，做ELISA實(shí)驗(yàn)。

二抗在30min時(shí)反應(yīng)完全，在30分鐘之后增加反應(yīng)時(shí)間，吸光值無(wú)明顯變化，所以選擇30min為二抗反應(yīng)時(shí)間。

（9）顯色反應(yīng)時(shí)間的選擇：見表9、圖4

分別選擇10min，20min，30min，40min四個(gè)不同的顯色反應(yīng)時(shí)間做ELISA實(shí)驗(yàn)。

吸光度值在20min時(shí)最高，20min之后隨時(shí)間增加吸光值逐漸下降，所以選擇20min為最佳顯色時(shí)間。

綜上所述，所建立的的ELISA方法是以pH=9.6的CBS為緩沖液將抗原蛋白稀釋到5μg/mL，并加入到酶標(biāo)孔內(nèi)，每孔加入100μL，加蓋放入4℃冰箱中孵育24h，倒出孔內(nèi)液體，甩干，用每孔300μL 的PBST洗滌液洗板四次，拍干。后向每個(gè)酶標(biāo)孔內(nèi)加入300μL 1%BSA封閉液，放入37℃恒溫箱中孵育90min，封閉結(jié)束后，重復(fù)洗板過(guò)程四次，拍干。以pH=7.4的PBS為緩沖液將抗體蛋白稀釋到1.67μg/mL，并加入到酶標(biāo)孔內(nèi)，每孔加入100μL，放入37℃恒溫箱中孵育30min。反應(yīng)結(jié)束后重復(fù)洗板過(guò)程三次，拍干。以pH=7.4的PBS為緩沖液將酶標(biāo)二抗稀釋到1μg/mL，并加入到酶標(biāo)孔內(nèi)，每孔加入100μL，并放入37℃恒溫箱中孵育30min。反應(yīng)結(jié)束后重復(fù)洗板過(guò)程三次，拍干。向每個(gè)孔內(nèi)加入顯色液100μL，放入37℃恒溫箱中孵育20min，充分顯色。反應(yīng)結(jié)束后向孔內(nèi)加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)于450nm處，在5min之內(nèi)測(cè)定每孔吸光值。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）酶標(biāo)板的制備：

以pH=9.6的CBS緩沖液將抗原蛋白稀釋到5μg/mL，加入酶標(biāo)孔內(nèi)，每孔加入100μL，加蓋放入4℃冰箱中孵育24h，倒出孔內(nèi)液體，甩干，用每孔300μL的PBST洗滌液洗板四次，拍干。后向每個(gè)酶標(biāo)孔內(nèi)加入100μL1%BSA封閉液，并放入37℃恒溫箱中孵育90min，封閉結(jié)束后，重復(fù)洗板過(guò)程四次，拍干，待用。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：見表10、圖5、圖6

以11ng/mL、4.4ng/mL、2.2ng/mL、1.1ng/mL、 0.44ng/mL、0.11ng/mL、0.044ng/mL、0.011ng/mL、0ng/mL九個(gè)不同濃度的萊克多巴胺溶液為標(biāo)準(zhǔn)系列，分別將九種溶液先與3.34μg/mL的抗體溶液等體積混合，并放入37℃恒溫箱中孵育10min，再以100μL/孔加入到已經(jīng)制備好的酶標(biāo)板中，并放入37℃恒溫箱中孵育30min。反應(yīng)結(jié)束后重復(fù)洗板過(guò)程三次，拍干。將1μg/mL的二抗加入到酶標(biāo)孔內(nèi)，每孔加入100μL，并放入37℃恒溫箱中孵育30min。反應(yīng)結(jié)束后重復(fù)洗板過(guò)程三次，拍干。向每個(gè)孔內(nèi)加入顯色液100μL，放入37℃恒溫箱中孵育20min，充分顯色。反應(yīng)結(jié)束后向孔內(nèi)加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)定為450nm，在5min內(nèi)測(cè)定每孔的吸光值，并以LogC為橫坐標(biāo)，LnA/（A。-A）為縱坐標(biāo)，（C為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度、A為各標(biāo)準(zhǔn)溶液所測(cè)吸光度、A。為空白吸光度）繪制系列萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)液的工作曲線；同時(shí)作空白實(shí)驗(yàn)，以空白作參比。

該標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：

y=-0.5356x-0.4146，相關(guān)系數(shù)R2=0.9799；IC50=0.108

（3）樣品的前處理方法優(yōu)化

方法一：稱取2.0g陰性豬肉樣品至50mL離心管中，加入不同濃度萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，震蕩混勻。加入4mL樣品酸性提取液，震蕩，用0.02mol/LNaOH溶液調(diào)pH值至7～8之間，以3000轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，取上清液按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法分析。結(jié)果見表11。

結(jié)果表明：方法一不能有效的提取出樣品中的萊克多巴胺。

方法二：稱取2.0g陰性豬肉樣品至50mL離心管中，加入不同濃度萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，震蕩混勻。加入4mL甲醇，混勻，超聲波提取5min，5000轉(zhuǎn)/min離心2分鐘，取上清液1mL，用氮吹儀吹干，用PBS復(fù)原至1mL按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法分析。結(jié)果見表12。

結(jié)果表明：方法二能較好的提取出樣品中的萊克多巴胺。

方法三：稱取2.0g陰性豬肉樣品至50mL離心管中，加入不同濃度的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，震蕩混勻，加入4mL甲醇，混勻，超聲波提取5min，5000轉(zhuǎn)/min離心2分鐘，取上清液1mL，加入正己烷出去油脂，棄去上層正己烷，用氮吹儀吹干甲醇，用PBS復(fù)原至1mL按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法分析，結(jié)果見表13。

結(jié)果表明：方法三能提取出樣品中的萊克多巴胺，但是提取效果不理想。

綜合方法一、二、三的提取效果，選用方法二處理樣品：稱取2.0g陰性樣品至50mL離心管中，震蕩混勻。加入4mL甲醇，混勻，超聲波提取5min，5000轉(zhuǎn)/min離心2分鐘，取上清液1mL，用氮吹儀吹干，用PBS復(fù)原至1mL按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法分析。

（4）最低檢出限實(shí)驗(yàn)：見表14

分別將0.011ng/mL、0.0044 ng/mL、0.0011ng/mL、0.00044ng/mL、0.00011ng/mL五種不同濃度的萊克多巴胺溶液為標(biāo)準(zhǔn)系列。分別將五種溶液先與3.34μg/mL的抗體溶液等體積混合，并放入37℃恒溫箱中孵育30min，再以100μL/孔加入到板中，做ELISA實(shí)驗(yàn)。選出該方法能檢出的最小濃度。

結(jié)果表明，該方法不能對(duì)0.00044 ng/mL及更小的濃度做出響應(yīng)，對(duì)0.0011ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品有響應(yīng)，但是所得吸光值不符合標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以該方法最低檢出限為0.0044ng/mL。

（5）交叉實(shí)驗(yàn)：見表15

分別將11ng/mL萊克多巴胺、11ng/mL鹽酸克倫特羅、11ng/mL沙丁胺醇三種溶液先與3.34ug/mL的抗體溶液等體積混合，并放入37度反應(yīng)30min，再以100μL/孔加入到板中，做ELISA實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果表明：鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇和未加任何標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值變異系數(shù)小于10%，符合ELISA實(shí)驗(yàn)要求，鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇對(duì)萊克多巴胺的檢測(cè)無(wú)干擾。

（6）回收率實(shí)驗(yàn)

陰性豬尿樣品加標(biāo)，使待檢樣品中濃度為0.44ng/mL、1.1ng/mL、2.2ng/mL。豬尿樣無(wú)需任何前處理可以直接測(cè)定。結(jié)果見表16。

豬尿中加標(biāo)回收率在72%～89%之間。

陰性豬肉樣品中加標(biāo)：稱取2.0g陰性樣品至50mL離心管中，加入不同濃度的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，震蕩混勻。加入4mL甲醇，混勻，超聲5min，5000轉(zhuǎn)/min離心2分鐘，取上清液1mL，用氮吹儀吹干，用PBS復(fù)原至1mL按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法分析。結(jié)果見表17。

結(jié)果表明該方法回收率可達(dá)65%～84%。

2 結(jié)語(yǔ)

該方法與經(jīng)典的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法有所區(qū)別，沒(méi)有將抗體和標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)加入到孔中與抗原競(jìng)爭(zhēng)，而是先讓抗體和標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)一段時(shí)間，讓方法檢出限更低，達(dá)到0.0044ng/mL，并以LogC為橫坐標(biāo)，LnA/（A。-A）為縱坐標(biāo)，得到線性方程y=-0.5356x-0.4146，相關(guān)系數(shù)R2=0.9799，IC50<1ng。通過(guò)交叉試驗(yàn)和回收率實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法具有較好地穩(wěn)定性和可靠性，能滿足實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)要求。

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