摘要：本研究利用減除法，用殼聚糖在最佳條件下澄清得到茶浸提液上清液及茶沉淀（冷后渾），分析了綠茶浸提液和上清液的理化性質(zhì)。發(fā)現(xiàn)澄清后的綠茶浸提液，茶多酚含量下降了26.99%，兒茶素含量下降了75.08%，氨基酸含量下降了86.01%，蛋白質(zhì)含量下降了73.43%，咖啡堿含量下降了19.92%。用乙醇除去蛋白后上清液中蛋白質(zhì)含量下降38.62%，茶湯濁度可降至74.9±0.57NTU；用PVPP去除多酚20.17%，兒茶素含量59.8%，茶湯濁度可降至10.34±2.49。用三氯甲烷去除咖啡堿，溶液的濁度達345±3.43NTU，沒有明顯變化，在溶液中添加咖啡堿溶液，溶液的濁度也沒有明顯變化。明確綠茶了的渾濁物主要是蛋白質(zhì)—多酚絡合類型的渾濁。

關(guān)鍵詞：茶冷后渾 澄清 浸提液 茶多酚 蛋白質(zhì)

中圖分類號：TS272.51 文獻標識碼：A 文章編號：1672-5336（2014）18-0015-03

1 前言

茶飲料在貨架期間所產(chǎn)生的非微生物污染的渾濁稱作冷后渾，傳統(tǒng)的觀點認為是由茶湯中的茶多酚、咖啡堿、蛋白質(zhì)、少量多糖以及疏水性脂質(zhì)、葉綠素、金屬離子等物質(zhì)間相互作用而形成渾濁沉淀的復雜過程。目前比較理想的辦法是先將茶湯冷卻到5℃以下，此時茶湯會很快變成霧狀渾合物；讓其在低溫下充分形成“茶乳酪”后，濾去“茶乳酪”再進行后續(xù)加工[1，2]。其他解決途徑還有離子絡合法和包埋法、酶法、膜分離法等[3]。引入外源酶是茶飲料生產(chǎn)中較為先進的技術(shù)，但酶價格昂貴，因此在國內(nèi)尚處于研究階段而未得到實際應用。

2 材料和方法

2.1 主要材料與試劑

綠茶：福建安溪新美茶葉加工公司產(chǎn)蒸青綠茶；聚乙烯吡咯烷酮（K30）（進口分裝）：中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑公司；三氯甲烷（AR）：國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇（AR）：上海振興化工一廠；二甲基甲酰胺（AR）：上?；瘜W試劑公司；咖啡堿（AR）： ACROS ORGANICS，New Jersey，USA。

2.2 實驗方法

2.2.1 單寧和蛋白質(zhì)—單寧渾濁定性實驗

根據(jù)Van Buren的方法來確定果汁中渾濁物是否為單寧和蛋白質(zhì)—單寧類型的渾濁。具體操作過程是：將3倍體積的二甲基甲酰胺添加到1倍體積的渾濁茶湯中，渾勻，5分鐘后觀察渾合物的澄清度[4]。對照為將3倍體積的蒸餾水添加到1倍體積的茶湯中。將處理樣與對照樣比較。渾濁物主要含有單寧或蛋白質(zhì)—單寧的茶湯在75%的二甲基甲酰胺溶液中其渾濁物會消失，而主要含淀粉、糊精、微生物和無機成分等渾濁物在此條件下則不受影響。

2.2.2 綠茶上清液制備

在預備試驗中，首先確定萃取原料綠茶的最佳工藝條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：茶水比1：12，萃取溫度90℃，萃取時間15min時得到的茶浸提液澄清度、香味和口感都達到最佳。通過正交實驗得出此條件下綠茶浸提液的最佳澄清工藝：反應時間55min，殼聚糖用量0.4%，綠茶的pH為4.1，溫度為4℃時，綠茶湯的濁度只有1.23NTU。

茶葉的浸提→200目濾布過濾→濾紙過濾→加入殼聚糖溶液→攪勻→4℃靜置→濾去絮凝物→離心→取上清液進行分析。

2.2.3 綠茶上清液及茶湯成分含量的測定

蛋白質(zhì)和氨基酸測定：蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍G250染色法進行。取0.500mL樣品，加0.500mol/L的氯化鈉溶液，再添加5mL考馬斯亮藍G-250染液，渾勻后，放置5min，然后在5—20min內(nèi)完成測定。標樣為牛血清蛋白。（y=0.5188x+0.0601 R2=0.9999）

游離氨基酸的組分采用HP1100高壓液相色譜進行分析，色譜柱為PICO.TAG氨基酸分析柱[5]。分析條件為：柱溫38℃，流動相A為20mmol醋酸鈉液，流動相B為20mmol醋酸鈉液：甲醇：乙腈（1：2：2，v/v），流速1.0mL/min，檢測波長254nm。

咖啡堿的測定：咖啡堿的測定采用堿式乙酸鉛比色法。以蒸餾水為空白，用移液管吸取試液20mL移入250mL容量瓶中，加入10mL0.01mol/L鹽酸和2mL堿式乙酸鉛溶液，用水稀釋至刻度，搖勻，過濾；再吸取濾液50mL于100mL容量瓶中，加9mol/L硫酸0.2mL，定容比色皿中定容、渾勻、靜置過濾后用紫外可見分光光度計測定在274nm處的吸光度。（y=44.28698x+0.0053 R2=0.9999）。

茶多酚測定：茶多酚含量采用Folin-Ciocaltear比色方法進行。取1.0mL樣液于10mL的具塞試管中，加5mL濃度為10%的Folin-Ciocalteau試劑和4mL飽和碳酸鈉（75g/L），渾勻后在暗處靜置1小時，以沒食子酸濃度為10，20，30，40，50mg/100mL做標準曲線。（y=0.0113x+0.0871 R2=0.9995）。

兒茶素的測定：兒茶素含量測定采用香莢蘭素比色法進行。取10μL樣液于5mL容量瓶中，加1mL95%乙醇和1%香莢蘭素鹽酸溶液至刻度，放置40min，用紫外可見分光光度計測定在500nm處的吸光度。以兒茶素濃度為10，20，30，40，50μL做標準曲線。（y=0.01799x+0.04423 R2=0.9999）。

2.2.4 起渾活性物質(zhì)的測定

起渾活性蛋白的定性測量實驗：取100mL澄清溶液，加入100mL無水乙醇，用漩渦渾合器充分渾勻后經(jīng)4000rpm離心15min，收集上清為去蛋白樣品，測定上清液濁度和蛋白質(zhì)含量。以蒸餾水為空白，上述所得上清液為樣品，在50mL反應體系中添加1mg/mL明膠（濁度1.34±0.05NTU）至渾濁，測定所用明膠體積及溶液濁度[6]。

起渾活性單寧的定性測量實驗：取100mL澄清溶液，加入10gPVPP，用漩渦渾合器充分渾勻后經(jīng)4000rpm離心15min，收集上清為去多酚樣品，測定上清液濁度、多酚含量及兒茶素含量。以蒸餾水為空白，上述所得上清液為樣品，向50mL反應體系中添加1mg/mL單寧酸（濁度1.78±0.06NTU）至渾濁，測定所用單寧酸體積及溶液濁度。

咖啡堿的定性測量實驗：取100mL澄清溶液，加入100mL三氯甲烷萃取，再用70mL三氯甲烷萃取第二次，放出三氯甲烷層后剩余的溶液為去咖啡堿樣品，測定上清液濁度和咖啡堿含量。以蒸餾水為空白，上述所得上清液為樣品，在50mL反應體系中添加3mg/mL咖啡堿（濁度2.56±0.12NTU）至渾濁，測定所用咖啡堿體積及溶液濁度[7]。

2.2.5 綠茶汁濁度的檢測方法

綠茶汁濁度的測定：采用SGZ-3數(shù)顯濁度儀（上海悅豐儀器儀表有限公司）進行測定，取30mL綠茶汁于30mL的樣品池內(nèi)測定，以Nehelo濁度單位NTU表示。

3 結(jié)果分析

3.1 茶冷后渾沉淀的基本生物化學特征

茶浸提液在室溫放置1個星期后，肉眼上觀察非常渾濁，而且在瓶底可見明顯的沉淀物。

單寧和蛋白質(zhì)-單寧渾濁實驗表明，茶浸提液的渾濁物主要由單寧或蛋白質(zhì)-單寧復合物組成。從表1中可以看出，用殼聚糖澄清茶湯后，茶多酚（兒茶素）、蛋白質(zhì)、和咖啡堿的變化都很大，其中氨基酸的損失高達86.01%。因此將主要深入研究兩種添加劑澄清原果汁前后對這幾種成分的影響。

3.2 綠茶沉淀物和綠茶澄清液中氨基酸組成和蛋白質(zhì)含量的變化

在起渾活性蛋白定性試驗中，用乙醇除去蛋白后上清液中蛋白質(zhì)含量下降了38.62%，此時溶液的濁度為74.9±0.57NTU。在50mL去蛋白的上清液中加入明膠（一種蛋白質(zhì)，1mg/ml）0.5mL，溶液立即發(fā)生渾濁現(xiàn)象，濁度達到82.8±0.39NTU。隨著明膠添加量的增加，濁度也越來越大。當明膠加到3mL時，濁度達到979±1.72NTU（表2）。實驗結(jié)果表明茶湯中蛋白質(zhì)與茶多酚的結(jié)合可能是引起冷后渾的主要原因。

Asquith[7]認為多酚類親和性高的蛋白質(zhì)的特征為相對分子量較大，結(jié)構(gòu)開放松散，脯氨酸或其他疏水性氨基酸含量較高。Haslam[8]等在研究了甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和脯氨酸等一系列氨基酸對水解類單寧親水性的影響之后，證實了氨基酸脂肪族基團越大，疏水性越強，多酚的結(jié)合越好。

3.3 茶多酚和兒茶素分析

經(jīng)過殼聚糖澄清后茶湯中的茶多酚下降了26.99%。茶湯中兒茶素的含量是澄清前的24.98%，損失達到75.02%。在起渾活性多酚定性的實驗中，用PVPP去除多酚后，多酚含量為12.42g/mL，下降了20.17%，兒茶素含量下降了59.8%，此時濁度是10.34±2.49。在50mL.去多酚后的溶液中再逐滴加入單寧酸至10mL時，溶液中會產(chǎn)生渾濁，濁度達到57.7±6.78NTU，隨著單寧添加量的增加，濁度也越來越大。表明茶多酚（特別是兒茶素）是產(chǎn)生冷后渾的主要原因之一。

3.4 咖啡堿成分分析

用堿式乙酸鉛比色法對咖啡堿成分進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用殼聚糖澄清茶湯后，上清液中咖啡堿的含量是澄清前的80.18%，茶浸提液中有19.92%的咖啡堿損失。

3.5 冷后渾形成的機理探討

在實驗中發(fā)現(xiàn)，在綠茶浸提液中添加殼聚糖后，形成的綠茶上清液的顏色和味道有所改變，而茶多酚是影響茶浸提液顏色、味道的主要原因，其中以兒茶素（黃烷-3-醇衍生物）最多，占茶多酚的65%-80%。簡單兒茶素（EC、EGC）滋味醇和，酯型兒茶素（EGCG、ECG）具較強苦澀味和收斂味；黃酮類為黃色或黃綠色色素[9]。

4 結(jié)語

（1）綠茶的渾濁物主要是蛋白質(zhì)—多酚類型的渾濁。殼聚糖/最佳工藝澄清綠茶浸提液后，茶多酚含量下降了26.99%，兒茶素含量下降了75.08%，氨基酸含量下降了86.01%，蛋白質(zhì)含量下降了73.43%，咖啡堿含量下降了19.92%。

（2）用乙醇除去蛋白后上清液中蛋白質(zhì)含量下降38.62%，此時溶液的濁度為74.9±0.57NTU；用PVPP去除多酚后，多酚含量下降了20.17%，兒茶素含量下降了59.8%，茶湯濁度可降至10.34±2.49。用三氯甲烷去除咖啡堿，溶液的濁度達345±3.43NTU，沒有明顯變化，在溶液中添加咖啡堿溶液，溶液的濁度也沒有明顯變化。

（3）實驗結(jié)果表明茶湯中蛋白質(zhì)與茶多酚的絡合可能是引起冷后渾的主要原因。

參考文獻

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[5]潘葉，黃惠華.殼聚糖與黃原膠對綠茶汁澄清效果的研究[J].中國食品添加劑，2010，（1）：65-69.

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[8]Haslam E Plat polyhenols Vegetable Tannis Revisited[J].Cambridge University Press.1989.10，70.

[9]陸建良，梁月榮. 蛋白質(zhì)與兒茶素和咖啡因互作對模擬茶湯透光率的影響[J].中國食品學報，2006，6（4）： 34-37.