王有虎 劉毅

[摘要]目的：研究腺病毒介導(dǎo)的肝細(xì)胞生長因子（HGF）轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對移植顆粒脂肪新生血管形成的影響。方法：分離培養(yǎng)雄性大鼠MSCs，用Ad-GFP、Ad-HGF轉(zhuǎn)染MSCs，流式細(xì)胞儀測定轉(zhuǎn)染效率。Wistar雌性大鼠150只，隨機(jī)分為5組：A組 顆粒脂肪+0.4mlDMEM-LG；B組 顆粒脂肪+0.4ml DMEM-LG+1×108pfuAd-HGF液；C組 顆粒脂肪+0.4mlDMEM-LG+1×106MSC ；D組顆粒脂肪+0.4ml DMEM-LG+1×106 MSC（攜帶GFP基因）；E組顆粒脂肪+0.4mlDME-LG +1×106 MSC（攜帶HGF基因），均勻震動5min，移植于背部皮膚與肌肉之間。3、5、7、14、28、60天取移植的顆粒脂肪組織，HE染色觀察病理變化，用免疫組化法檢測移植體CD34表達(dá)，觀察新生血管生成。結(jié)果：MOI=100時，Ad-GFP轉(zhuǎn)染MSCs效率達(dá)86.4%，Ad-HGF轉(zhuǎn)染MSCs，ELISA檢測HGF分泌量在48h表達(dá)量最高。E組移植體新生血管7天左右達(dá)高峰，14天后趨于平穩(wěn)，在5、7、14、28、60天血管數(shù)量多于其他組（P<0.05）。結(jié)論：攜帶有HGF基因骨髓間充干細(xì)胞有效的能促進(jìn)移植顆粒脂肪的血管形成。

[關(guān)鍵詞]肝細(xì)胞生長因子；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；顆粒脂肪移植；血管形成；基因轉(zhuǎn)染

[中圖分類號]R62 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）15-1260-04

Experimental study of transplanted mesenchymal stem cells transfected with adenoviral ventor mediated HGF gene enhance angiogenesis of grain fat grafts

WANG You-hu1，LIU Yi2

（1.Department of Otorhionolaryngology，Nead and Neck Surgery，The First Hospital Lanzhou University，Lanzhou 730000，Gansu，China；2.PLA Center of Plastic Surgery，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Command， Lanzhou 730050，Gansu，China）

Abstract： Objective To investigate the angiogenetic effect of transplanting mesenchyma stem cells （MSCs） transfected with HGF gene on fat grafts. Methods MSCs of male Wistar rats were collected and cultured in vitro，and were transfected with Ad - GFP or Ad-HGF.The transfection infectivity of Ad - GFP to MSCs was assayed by fluorescent microsopy and flow cytometry.150rats were randomly divided into 5groups： control group （group A，30rats），MSCs group （group B，30 rats），Ad-HGF group （group C， 30rats），MSCs transplanted with Ad-GFP group（groupD，30rats）， MSCs transplanted with Ad-HGF group（groupE， 30 rats）.Then free fat tissue from inguinal region，mixed with MSCs，Ad-HGF，MSCs transplanted with Ad-GFP and MSCs transplanted with Ad-HGF respective，were transplanted to rats back， but control group were only mixed with DMEM-LG. fat grafts were obtained on day 3，5，7，14，28，60 implantation，The expression of CD34 in fat grafts were detected by immunohistochemistry. Results Transfection efficiency was correlated with the multiplicity of infection （MOI）and a highest transfection efficiency （86.4）could be achieved at MOI of 100.MSC expressed HGF at a high level after being transfected with the Ad-HGF for 48h .The HGF expression could maintain for at least two weeks.Microvesselquantity in group E was much more than that in other group （P<0.05）.at post-transplantation day 5，7，14，28，60. Conclusion MSCs transfected with Ad-HGF can express continuous HGF and promote angiogenesis in grain fat grafts.

Key words：HGF；MSC；Fat grafts transplant；angiogenesis；gene transfection

Traktueue等[1]預(yù)測脂肪移植將來在修復(fù)組織缺損中將扮演重要的角色，但是顆粒脂肪移植后存在最大問題是移植脂肪因缺血、缺氧后液化壞死，易被吸收或形成囊腫、纖維化，從而影響遠(yuǎn)期效果。因此，脂肪移植要取得進(jìn)一步的進(jìn)展，就要深入研究脂肪移植后的再血管化[2-3]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類重要的干細(xì)胞，可跨胚層分化為各類細(xì)胞。其容易分離和培養(yǎng)擴(kuò)增，同時具有可移植性，易于外源基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)，是基因治療理想的載體細(xì)胞。肝細(xì)胞生長因子（ hepatic growth factor，HGF）是一種多功能的細(xì)胞因子，其生物學(xué)活性通過單一受體c-Met（c-met protoncogene product） 介導(dǎo)，引起細(xì)胞內(nèi)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的級聯(lián)激活，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、運(yùn)動和血管生成等?；诖?，我們用腺病毒為載體，把HGF基因?qū)牍撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞，然后與顆粒脂肪混合移植，充分發(fā)揮MSCs多項(xiàng)分化潛能和HGF強(qiáng)大的血管效應(yīng)，旨在為顆粒脂肪移植建立新生血管誘導(dǎo)生物組織工程模式。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料：Ad-GFP（攜帶綠色熒光蛋白的重組腺病毒）和Ad-HGF（攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的重組腺病毒），蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院哈小琴老師惠贈；Percoll試劑（Amersham Pharmacia Biotech公司）；兔抗人CD34多克隆抗體及SP試劑盒（武漢博士德生物工程公司）；DMEM-LG培養(yǎng)基（Gibco公司）；OLYMPUS XT70型熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）；流式細(xì)胞儀（BD公司，美國）；Imge-Pro Plus 圖像分析軟件（Version 4.1）（美國Media Cybernetics公司）。

1.2MSCs的分離、培養(yǎng)與擴(kuò)增：應(yīng)用Percoll（1.073g/ml）密度梯度離心法從健康雄性Wistar大鼠（體重120g）的骨髓中分離得到單核細(xì)胞，接種于含10%胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2 條件下培養(yǎng)，72h后換液。原代培養(yǎng)6d左右形成細(xì)胞克隆，約10天形成貼壁細(xì)胞層。胰蛋白酶消化后傳代擴(kuò)增，第3～5代用于實(shí)驗(yàn)。

1.3重組腺病毒介導(dǎo)GFP基因/HGF基因轉(zhuǎn)染MSCs：將細(xì)胞以1×106 接種于6孔板，貼壁后，棄去培養(yǎng)上清，加入含不同感染強(qiáng)度的Ad-GFP病毒顆粒的DMEM-LG培養(yǎng)基（0、25、50、100、200pfu/ cell）孵育2h，換含5%血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h檢測熒光。轉(zhuǎn)染48h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強(qiáng)度并用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。Ad-HGF感染采用Ad-GFP轉(zhuǎn)染率最高的病毒強(qiáng)度。

1.4實(shí)驗(yàn)動物分組處理及指標(biāo)檢測

1.4.1實(shí)驗(yàn)動物分組處理：150只雌性Wistar大鼠（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)科提、供）隨機(jī)分為：空白對照組（A組 n=30）、Ad-HGF組（B組 n=30）MSC組（C組n=30）、Ad-GFP感染MSC組（D組 n=30）、Ad-HGF感染MSC組（E組 n=30）。用3%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（40mg/kg）取腹股溝區(qū)脂肪1ml，均勻剪成小塊，用生理鹽水沖洗。A組 顆粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG；B組 顆粒脂肪1ml+0.4ml DMEM-LG+1х108pfuAd-HGF液；C組顆粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG+1×106MSC；D組顆粒脂肪1ml+0.4ml DMEM-LG+1×106MSC（攜帶GFP基因）；E組顆粒脂肪1ml+0.4mlDME-LG+1×106MSC（攜帶HGF基因）均勻震動5min，用注射器接12號針頭注射于背部的皮膚與肌肉之間。3、5、7、14、28、60天每次各組取5只脫頸處死，并沿被膜分離出移植物，標(biāo)本用10%富爾馬林固定，規(guī)制成石蠟切片， HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.4.2 血管染色和血管計數(shù)方法：按照免疫組化SP法操作步驟進(jìn)行，工作液濃度為1：150。每張切片分別在周邊區(qū)和中央?yún)^(qū)各選3個高倍（×4OO）視野，每個視野中進(jìn)行微血管計數(shù)，然后求其均值。凡是染成棕色單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均作為1個血管計數(shù)。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示， 并進(jìn)行單因素方差分析和多個樣本均數(shù)之間的多重比較，P<0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MSCs 的體外培養(yǎng)：從骨髓中分離獲取的單個核細(xì)胞培養(yǎng)24h后逐漸出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，換液逐漸除去未貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)4天可見似分裂中的成纖維樣細(xì)胞，6天可見多個細(xì)胞克隆形成似，12～14天細(xì)胞形態(tài)不一、多呈梭形，90%以上融合。傳代細(xì)胞于24h內(nèi)貼壁，10～12天融合。

2.2GFP基因/HGF基因在MSC中的高表達(dá)：Ad-GFP轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期MSCs 48h后在熒光顯微鏡下觀察，在低倍的視野下呈“滿天星”狀，在高倍視野發(fā)綠色熒光的MSC，呈不規(guī)則形，有些細(xì)胞的輪廓清晰可見，有些融合成片（如圖1）。當(dāng)MOI=100時，用FCM檢測GFP表達(dá)率89.6%，感染效率最高，說明重組腺病毒能夠有效的感染MSC。ELISA檢測HGF分泌量結(jié)果顯示，感染MSC后HGF基因可在短期內(nèi)高效表達(dá)，48h表達(dá)量最高（如圖2）。

2.3 移植顆粒脂肪組織的病理學(xué)變化：所有移植體均被纖維被膜包裹。移植后5、7天，E組有大量的血管長入移植物（如圖3）。鏡下，早期脂肪移植物內(nèi)及周圍有單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，其中A、B、C、D中央液化壞死明顯，只有周邊脂肪組織結(jié)構(gòu)完好；而E組壞死較少，且新生血管豐富，有些血管呈垂直狀向移植物延伸移植物。移植后26、60天E組包裹纖維被膜厚，而間隔較薄，體積保持明顯好于其他4組，細(xì)胞分化成熟。

2.4平均微血管密度記數(shù)：免疫組化染色后血管呈棕黃色，切片背景清晰，微血管形態(tài)不規(guī)則，管腔由染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞圍成（如圖4）。腔內(nèi)可見紅細(xì)胞，部分血管無明顯管腔呈條索狀，有的只見到單個或成團(tuán)的內(nèi)皮細(xì)胞， Ad-HGF轉(zhuǎn)染MSC組7天新生血管達(dá)到高峰，14天后趨于穩(wěn)定。與其他4組相比較，在第3天無差異，但在術(shù)后5、7、14、28、60天時均有差異（P<0.05），如圖5。

3 討論

隨著目前分子生物學(xué)、基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)的發(fā)展，為加速顆粒脂肪移植后血管的重建提供了新的思路。

HGF是一種特異的促內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有很強(qiáng)促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂、增生，抑制凋亡作用。在兔與小鼠缺血模型中，HGF 能刺激新生血管生成，且不論在體內(nèi)還是體外試驗(yàn)HGF 的血管生成活性比血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）更為強(qiáng)大[4]。但是，HGF半衰期短，費(fèi)用高，局部給藥困難等缺點(diǎn)而難以推廣應(yīng)用。而我們在HGF基因加速創(chuàng)面血管新生方面已取得了一定的進(jìn)展[5]。

本實(shí)驗(yàn)以腺病毒為介導(dǎo)，將HGF基因?qū)塍w外培養(yǎng)的MSCs中，和大鼠自體顆粒脂肪混合移植到其背部，發(fā)揮HGF強(qiáng)大的血管作用和MSC多項(xiàng)分化作用，共同協(xié)同促進(jìn)顆粒脂肪移植體的新生血管。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ad- HGF轉(zhuǎn)染MSC組新生血管生成7天達(dá)高峰，提前于其他四組和文獻(xiàn)報道[6]的14天，且無論在早期還是長期移植體血管的數(shù)量明顯多于其他4組（P<0.05），從這種差異也說明了HGF起到促血管生成作用。HGF促血管生成的分子學(xué)機(jī)制可能是通過ets途徑[7]。ets 家族轉(zhuǎn)錄因子有DNA 連接區(qū)，能連接到DNA 序列GGA 的核心上，對多種發(fā)生和促有絲分裂信號反應(yīng)的基因表達(dá)起了非常重要的作用。原癌基因c-met，無論在正常還是病理?xiàng)l件下，在新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞上均有表達(dá)。因此，ets 家族可能激活了基因編碼的膠原酶l和尿激酶纖溶酶原激活劑等的活性。ets 家族可能通過控制這些基因的轉(zhuǎn)錄而參與了血管生成的調(diào)節(jié)。外源HGF通過誘導(dǎo)ets活性可以刺激內(nèi)源性HGF表達(dá)；內(nèi)源性HGF系統(tǒng)通過自動傳導(dǎo)功能，促進(jìn)小血管生成[8]。

MSCs不僅免疫毒性很低，易于外源基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，而且移植后可促進(jìn)新生血管的生成，其途徑：①M(fèi)SC產(chǎn)生VEGF、bFGF、PDGF血管生成素；②能分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示MSC組的新生血管平均數(shù)量多余空白對照組。至于MSC是否像文獻(xiàn)報道那樣能分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，有待進(jìn)一證明。

本實(shí)驗(yàn)選用腺病毒為載體，該病毒有以下優(yōu)點(diǎn)：安全、無致畸，致病及致癌性；對分裂細(xì)胞及癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90%～100%；腺病毒感染細(xì)胞時DNA不整合到宿主細(xì)胞染色體中；腺病毒容易制備、純化和濃縮，可達(dá)到較高滴度；腺病毒載體插入外原基因的容量較大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通過腺病毒介導(dǎo)，GFP基因/HGF基因成功導(dǎo)入MSCs，并高效表達(dá)。

綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞生長因子基因后能持續(xù)的表達(dá)HGF，從而有效的促進(jìn)自體顆粒脂肪移植后新生血管的生成，有望提高脂肪移植的遠(yuǎn)期效果。但是要將基因治療與干細(xì)胞移植真正應(yīng)用于臨床，必須進(jìn)一步研究這種促血管生物工程模式的安全性、穩(wěn)定性和可控性。

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[收稿日期]2014-06-10 [修回日期]2014-07-15

編輯/何志斌