劉亞南　郭杰　張煒

隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和人們生活水平的日益提高，在滿足物質(zhì)和精神需求的同時，人們對美的要求也不斷提高，迫切需要一種安全、簡單、有效的美容方式。微整形應(yīng)運而生，注射美容手術(shù)為微整形的典型代表，其原理為直接將填充物注射于患者皮下或特定部位，來改善局部外觀，從而達(dá)到美容的效果，已廣泛應(yīng)用于除皺、局部凹陷填充、隆鼻、隆乳等美容手術(shù)。關(guān)于理想的注射用填充劑的選擇一直在探索中，理想的軟組織填充劑應(yīng)具備以下優(yōu)點：局部注射不引起變態(tài)反應(yīng)或炎癥反應(yīng)；不易機化、變性、壞死或被周圍組織吸收；不會因吞噬作用被清除；在形態(tài)上具有一定的支撐作用，能保持相對固定的體積和柔韌度；無游走性，塑形效果相對穩(wěn)定。注射美容手術(shù)的發(fā)展很大程度上依賴于注射材料的選擇，利用脂肪組織工程技術(shù)選擇合適的注射材料已成為研究熱點。

脂肪組織工程技術(shù)是利用脂肪干細(xì)胞和相應(yīng)的生物支架材料對病變的組織和器官進(jìn)行修復(fù)重建。選擇合適的種子細(xì)胞和生物支架材料并建立兩者間三維空間結(jié)構(gòu)是脂肪組織工程技術(shù)的關(guān)鍵。合適的種子細(xì)胞應(yīng)滿足以下幾點：增殖能力及分化能力較強，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)誘導(dǎo)劑可調(diào)控其分化方向；生存周期較長，對培養(yǎng)基的要求較低；取材簡單，易從相應(yīng)組織中分離提取。Yoo等[1-2]研究指出合適的細(xì)胞支架材料必須符合：支架材料的形態(tài)和結(jié)構(gòu)對新生組織生長起到引導(dǎo)作用；起到載體的作用，可將種子細(xì)胞輸送到指定的空間；可為種子細(xì)胞的新陳代謝提供場所，清理代謝所產(chǎn)生的廢物，并不斷為新陳代謝提供營養(yǎng)；材料表面的特殊位點與種子細(xì)胞有特異性的粘附作用；起到機械支架的作用，能夠維持組織原有的機械結(jié)構(gòu)；可作為種子細(xì)胞活性因子的載體。

1 脂肪組織工程的研究現(xiàn)狀

1.1 脂肪組織工程的原理和方法：傳統(tǒng)的填充方法包括同種自體移植、同種異體移植、異種異體移植及人工替代品。但這些方法常由于組織細(xì)胞的凋亡壞死、延遲的血循重建、組織萎縮等原因而無法達(dá)到理想效果[3]。而脂肪組織工程技術(shù)被認(rèn)為是替代傳統(tǒng)脂肪移植術(shù)最理想的方法。脂肪組織工程技術(shù)包含幾大重要部分[4]，包括理想的種子細(xì)胞，合適的生物支架材料及適宜的微環(huán)境。脂肪組織工程技術(shù)是利用脂肪干細(xì)胞和相應(yīng)的生物支架材料對病變的組織和器官進(jìn)行修復(fù)重建

1.2 脂肪組織工程的研究策略：關(guān)于脂肪組織工程的研究策略，國內(nèi)外學(xué)者經(jīng)過不斷的研究，總結(jié)如下：①利用相應(yīng)的生物支架材料引導(dǎo)組織再生的脂肪組織工程（Scaffold guided tissueregeneration）：將種子細(xì)胞與生物支架材料以適當(dāng)比例混合[5]，植入機體缺損或病變部位，種子細(xì)胞不斷地增殖分化，支架材料在此過程中為其提供適宜其生長的微環(huán)境，同時其在體內(nèi)不斷降解并吸收，從而形成與機體正常組織功能、形態(tài)相接近的再生組織，進(jìn)而形成新的脂肪組織，達(dá)到對缺損及病變組織修復(fù)及重建的目的；②可注射復(fù)合材料脂肪組織工程技術(shù)（Injectable composite system）：將凝膠介質(zhì)與微載體復(fù)合材料混合，并注射到機體病變或缺損的部位，微載體凝膠復(fù)合物可刺激機體脂肪細(xì)胞增殖從而達(dá)到對病變或缺損部位修復(fù)重建的目的[6-7]；③腹網(wǎng)膜的脂肪組織工程技術(shù)[8]（Fragmented omentumbased-tissueregeneration）：腹網(wǎng)膜組織含有豐富的脂肪組織及血管，可為種子細(xì)胞的生長提供良好的微環(huán)境，將腹網(wǎng)膜組織處理成碎片，并將其與脂肪干細(xì)胞混合，植入人體缺損部位，缺損部位脂肪組織大量增加，在一定程度上對缺損部位起到修復(fù)重建的目的；④相關(guān)生長因子促進(jìn)脂肪組織再生的脂肪組織工程技術(shù)[9-10]（Denovo adipogenesis）：將脂肪干細(xì)胞與相關(guān)生長因子一同使用，并注射到機體所需要的部位，生長因子可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞大量增殖，從而使得分化的脂肪組織大量增加，對病變部位進(jìn)行修復(fù)、對缺損部位進(jìn)行重建。

1.3 脂肪組織工程的關(guān)鍵：脂肪組織工程的研究策略千變?nèi)f化，但其關(guān)鍵在于如何選擇理想的種子細(xì)胞、合適的支架材料。研究發(fā)現(xiàn)，以來源于脂肪組織的脂肪干細(xì)胞復(fù)合相關(guān)生物支架作為填充物，可明顯促進(jìn)軟組織的血管化、提高移植物的存活率。應(yīng)用組織工程技術(shù)將種子細(xì)胞復(fù)合不同生物支架作為填充物為臨床提供一個新的研究方向。其中種子細(xì)胞可以選為脂肪干細(xì)胞，細(xì)胞支架材料可以選擇游離脂肪顆粒和相關(guān)注射材料（透明質(zhì)酸鈉、膠原等）。

2 種子細(xì)胞的相關(guān)研究

2.1 ADSCs的發(fā)現(xiàn)和命名：Zuk等[11]于2001年首次從脂肪組織中分離并提取出成體細(xì)胞，命名為Processed Lipoaspirate cells（PLAS），即抽脂術(shù)細(xì)胞，并得到了快速的發(fā)展。隨著研究的不斷深入，學(xué)者們也從不同研究角度給予該細(xì)胞不同命名。現(xiàn)在比較公認(rèn)的稱為脂肪來源干細(xì)胞（ADSCs）。

2.2 ADSCs的分離和純化： 脂肪干細(xì)胞來源廣泛，較易于從人體或動物的脂肪組織中分離提取，ADSCs的提取方法很多，但提取出來的都非單一的脂肪干細(xì)胞，而是相關(guān)的細(xì)胞群。在整形外科領(lǐng)域，我們所需的脂肪組織常來源于脂肪抽吸術(shù)的患者，將所得脂肪組織用組織剪剪成細(xì)小的顆粒，并用PBS液沖洗干凈，用0.1%的膠原酶在37℃下進(jìn)行消化，置DMEM培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)，并加入10%胎牛血清。進(jìn)行離心，棄其上清液及游離脂肪組織，經(jīng)過濾純化后將所得細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，2天后換液，以后3天換液一次，收集第3代細(xì)胞作為種子細(xì)胞。我們無法直接純化脂肪干細(xì)胞，常通過純化脂肪組織來間接達(dá)到純化脂肪干細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：傳至第3代時，脂肪干細(xì)胞的純度可達(dá)到95%以上。

2.3 ADSCs的生物學(xué)特性

2.3.1 ADSCs可分泌多種生長因子：研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞在一定條件下可產(chǎn)生多種生長因子，如：血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）、胎盤生長因子（PGF）及成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等。其分泌的血管內(nèi)皮生長因子可促進(jìn)血管生成、抗凋亡作用、成纖維細(xì)胞生長因子具有趨化作用、免疫抑制及造血支持作用。

2.3.2 ADSCs的多向分化能力：脂肪干細(xì)胞具有較強的增殖能力和生命周期、排斥反應(yīng)低、取材簡單方便、能建立標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞系等優(yōu)點。在一定條件下可分化為特定的體細(xì)胞，在組織工程研究領(lǐng)域有著巨大價值：① ADSCs可向脂肪細(xì)胞分化：Zuk等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在一定條件培養(yǎng)基中加入適量的胰島素、地塞米松、吲哚美辛，3周后可檢測出ADSCs表達(dá)許多脂肪細(xì)胞的特異性標(biāo)記：脂蛋白脂肪酶、脂肪酸結(jié)合蛋白aP2、PPAR-r2、lepIin（瘦素）、Glut4（葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4）等。顯微鏡下可見空泡結(jié)構(gòu)形成。組織學(xué)證明新生的細(xì)胞為脂肪細(xì)胞；② ADSCs可向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化：將ADsCs置于含甲基纖維素和血管內(nèi)皮生長因子的、特定培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。鏡下可見有分支狀的管腔結(jié)構(gòu)形成，免疫組化證實有內(nèi)皮細(xì)胞特異性的表面標(biāo)記CD3l和vW因子。Plarlat等[13]研究發(fā)現(xiàn)將培養(yǎng)一定時間的ADSCs注入小鼠后肢缺血的肌肉中，15天后，經(jīng)血管造影及超聲檢查顯示小鼠缺血征像明顯改善，此項研究表明ADSCs在一定條件下可向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化；③ADSCs向成骨細(xì)胞分化：Zuk等、Christian等研究結(jié)果顯示，在特殊培養(yǎng)基誘導(dǎo)下，h-ADSC8在加入維生素C、B一磷酸甘油（BGP）和維生素D3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾代后，細(xì)胞表面形成的突起，其形態(tài)與體內(nèi)的成骨細(xì)胞相似，用茜素紅染色可見細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了鈣小結(jié)，ADSCs形態(tài)發(fā)生變化，且能表達(dá)堿性磷酸酶等相關(guān)標(biāo)記，表現(xiàn)出成骨細(xì)胞的特性。國內(nèi)有學(xué)者[14]證實了此點，在體外經(jīng)成骨誘導(dǎo)后其堿性磷酸酶活性及細(xì)胞外基質(zhì)礦化程度較對照組明顯升高，均表現(xiàn)出成骨分化的特性；④向軟骨細(xì)胞分化：在體外，將維生素C、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素添加到特定培養(yǎng)基里，可以定向誘導(dǎo)ADscs向軟骨細(xì)胞分化。結(jié)果在培養(yǎng)基里形成了細(xì)胞小結(jié)，經(jīng)免疫組化分析得知，這些細(xì)胞小結(jié)表達(dá)Ⅱ型膠原纖維、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素[15]。楊亞軍[16]用CDMPl體外誘導(dǎo)sD大鼠脂肪干細(xì)胞，結(jié)果誘導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞形態(tài)由長梭型向軟骨細(xì)胞的多角形方向轉(zhuǎn)變。免疫組化顯示CDMPI誘導(dǎo)大鼠ADsCs后可以分泌軟骨特異性基質(zhì)糖胺聚糖（GAG）和Ⅱ型膠原，并進(jìn)一步向軟骨細(xì)胞方向分化增殖[17]；⑤向心肌細(xì)胞分化：從脂肪組織中分離的脂肪基質(zhì)血管組分（SVF）即不含成熟脂肪細(xì)胞的脂肪組織，且具有干細(xì)胞特性，直接種植在半固體的甲基纖維素培養(yǎng)基中，6d后，出現(xiàn)了各種不同的細(xì)胞形態(tài)，有成群的前脂肪細(xì)胞/脂肪細(xì)胞，成纖維樣細(xì)胞等等，11～14天后，一些圓形的細(xì)胞開始了獨立的收縮活動，在幾天內(nèi)，肌管樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，并大量生長增殖，20～30天后，局部出現(xiàn)了一簇有結(jié)合力的細(xì)胞群體，和有分支的纖維細(xì)胞共同結(jié)合在一起。在這期間，24天時，整個局部出現(xiàn)了單一節(jié)律的搏動。在分子水平上，這些搏動的細(xì)胞能表達(dá)幾種心臟特有的mRNA，如：轉(zhuǎn)錄因子，GATA-4和心室和心房肌凝蛋白輕鏈。這些數(shù)據(jù)表明了這些搏動細(xì)胞的心肌細(xì)胞特性[18-20]。向神經(jīng)細(xì)胞方向分化：國外一些研究人員用B-巰基乙醇（B-mercaptoethanol，B-ME）誘導(dǎo)h-ADSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，30min后即出現(xiàn)類神經(jīng)元樣的細(xì)胞，3h后出現(xiàn)了神經(jīng)元細(xì)胞表型，表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞早期階段的標(biāo)志性因子，這證明了ADSCs能在體外分化為神經(jīng)前體細(xì)胞，目前技術(shù)水平尚不能使之向成熟的神經(jīng)元細(xì)胞或星型膠質(zhì)細(xì)胞分化[21-23]。

3 支架材料的相關(guān)研究

3.1 支架材料的性質(zhì)：細(xì)胞支架材料是組織工程的核心內(nèi)容之一，理想的支架材料對組織工程的實驗結(jié)果會產(chǎn)生巨大的影響，應(yīng)滿足：①可降解性；②排斥反應(yīng)小，與組織相容性好；③適合種子細(xì)胞嵌入的孔徑；④合適的表面積及理化性質(zhì)；⑤其結(jié)構(gòu)強度能與植入部位組織的力學(xué)性能相匹；⑥具有一定的可塑性。

3.2 支架材料的作用：支架材料在組織工程中起到了至關(guān)重要的作用：①支架材料可引導(dǎo)種子細(xì)胞的生長；②為種子細(xì)胞的生長提供空間；③提高營養(yǎng)，清除廢物；④對不同的種子細(xì)胞有特征性連接位點，可使種子細(xì)胞特異性粘附于支架材料的特殊位點；⑤不會改變組織本身的形態(tài)；⑥可作為某些細(xì)胞因子的載體。

3.3 支架材料的種類：脂肪組織、透明質(zhì)酸和膠原為組織工程中常用的生物支架，也廣泛應(yīng)用于整形外科領(lǐng)域，可以與脂肪干細(xì)胞相結(jié)合，兩者具有一定的協(xié)同作用。脂肪顆?？蓙碓从谌梭w或動物皮下脂肪，取材廣泛、簡單、足量，且與機體相容性好、排斥性較低，是組織工程中天然的生物支架。研究證明脂肪來源干細(xì)胞在向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的同時也可向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，并分泌EGF、FGF等生長因子，改善局部血液循環(huán)，促進(jìn)局部細(xì)胞增生分裂從而減少細(xì)胞缺血時間，降低細(xì)胞液化吸收比率，使脂肪來源干細(xì)胞和脂肪顆粒兩者具有一定的協(xié)同作用。透明質(zhì)酸基本成分為高分子多糖，是世界上公認(rèn)的保濕劑，在一定條件下極易降解，且免疫排除性較小，已廣泛應(yīng)用于骨科關(guān)節(jié)疾病的治療，作為組織工程支架具有廣闊的前景。膠原是屬于細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，廣泛存在于脊椎動物和人的皮膚、肌腱、韌帶、軟骨及骨等組織或器官中。它的主要成分是糖蛋白。約占機體總蛋白的25%。膠原具有很好的生物學(xué)性能，是目前組織工程研究中最常用的天然生物支架材料[24]。在整形外科領(lǐng)域，這三種支架材料已得到了廣泛的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，生物支架材料可為種子細(xì)胞的生長提供合適的三維空間結(jié)構(gòu)及適宜的微環(huán)境，在一定程度上可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的生長和分泌。

4 脂肪組織工程研究展望

自體脂肪移植已廣泛應(yīng)用于臨床，是整形外科醫(yī)生對臨床組織缺損患者進(jìn)行修復(fù)重建的一種常規(guī)方法，但單純脂肪移植存活率低、吸收率高，不能達(dá)到理想的效果，限制其在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用。利用組織工程技術(shù)將種子細(xì)胞和相應(yīng)的生物支架結(jié)合，從而構(gòu)建相應(yīng)的組織和器官，是組織工程的關(guān)鍵。將種子細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增，并與相應(yīng)支架材料構(gòu)建三維空間結(jié)構(gòu)，從而形成種子細(xì)胞生物支架復(fù)合物，并將其植入機體，對病變或缺損的組織和器官進(jìn)行修復(fù)。在此過程中，種子細(xì)胞不斷擴(kuò)增，來滿足正常組織的需要，相應(yīng)的生物支架材料為種子細(xì)胞的生長增殖提供適宜的微環(huán)境，并與機體有良好的相容性，且能不斷降解，被機體吸收。從而使種子細(xì)胞生物支架復(fù)合物能形成與機體在形態(tài)和功能上較一致的組織，達(dá)到對機體修復(fù)重建的目的。

李劼、高建華、魯峰等[26]將脂肪干細(xì)胞與脂肪顆粒以適當(dāng)比例混合后注射到裸鼠皮下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其組織塊的濕重、存活率、血管化程度等都顯著高于單純對照組，其研究證明脂肪干細(xì)胞與脂肪顆?；旌弦浦苍谝欢ǔ潭壬峡纱龠M(jìn)移植物的血管化程度，從而提高存活率、降低吸收率。這與我們的脂肪干細(xì)胞復(fù)合脂肪顆粒組的研究結(jié)果相符合。龐雪芬、張志光[27]將不同濃度的透明質(zhì)酸與小豬脂肪干細(xì)胞混合培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)適宜濃度的透明質(zhì)酸可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的增殖分化能力。這與我們的脂肪干細(xì)胞復(fù)合透明質(zhì)酸組的研究結(jié)果相符合。許穎溦、劉林嶓等[28]將脂肪干細(xì)胞與無菌膠原混合形成細(xì)胞支架復(fù)合物，注射于裸鼠皮下軟組織，取材后進(jìn)行相關(guān)檢測，其組織塊濕重、存活率、微血管密度均顯著高于單純脂肪顆粒移植組，證明無菌膠原作為生物支架在一定程度上可提高脂肪干細(xì)胞的促血管化作用。這些研究為組織工程中生物支架的選擇提供了理論基礎(chǔ)。基于此，脂肪顆粒、透明質(zhì)酸、無菌膠原做為本實驗的生物支架，可加速脂肪干細(xì)胞的促血管化作用，從而證明其作為組織工程中的生物支架材料具有一定的可行性。

傳統(tǒng)的整形外科手術(shù)創(chuàng)傷較大、術(shù)后并發(fā)癥較多、花費高及住院時間長等劣勢，不能適應(yīng)一些迫切需要微整形的患者需要。據(jù)美國的一項統(tǒng)計顯示，微創(chuàng)整形美容手術(shù)的數(shù)量逐年上升，充分整形美容手術(shù)符合社會發(fā)展的趨勢，易被廣大患者所接受。隨著微創(chuàng)整形美容的不斷發(fā)展，整形美容外科醫(yī)師的觀念也在逐漸轉(zhuǎn)變，微整形已成為一種趨勢。 選擇合適的種子細(xì)胞及支架材料，使得注射美容術(shù)安全有效是關(guān)鍵。

5 存在問題

脂肪干細(xì)胞作為理想的種子細(xì)胞擁有廣闊的應(yīng)用前景，它取材簡單、痛苦小、又不涉及相關(guān)倫理問題，但是要真正作為一種常規(guī)治療方法應(yīng)用于臨床，還有許多問題需要解決。所用脂肪干細(xì)胞由于其供體年齡、性別、取材方法及取材部位的不同可能會對其實驗結(jié)果造成一定影響，之前研究已經(jīng)證實，脂肪干細(xì)胞的增殖能力跟供體年齡成反比，脂肪干細(xì)胞的活性越強，增殖能力也越強。性別在一定程度上也會影響脂肪干細(xì)胞的增殖能力，女性脂肪組織中的脂肪干細(xì)胞其增殖能力要高于男性。取材部位也在一定程度上影響著脂肪干細(xì)胞的生長周期，從腹部組織中提取的脂肪干細(xì)胞其生存周期要遠(yuǎn)高于其他部位，這些有待于進(jìn)一步研究。在支架材料的應(yīng)用方面有諸多問題尚未解決，一種材料往往不能滿足種子細(xì)胞生長的需要，細(xì)胞支架材料的研究成了組織工程技術(shù)的重點。種子細(xì)胞的生長需要合適厚度的支架材料，當(dāng)支架材料的厚度超過1mm時可能無法為種子細(xì)胞提供充沛的營養(yǎng)支持，如何選擇合適厚度的支架材料，并為種子細(xì)胞的生長提供最適合的微血管環(huán)境有待于進(jìn)一步研究?？傊F(xiàn)階段研究已經(jīng)證實，脂肪干細(xì)胞復(fù)合相關(guān)生物支架作為注射美容術(shù)中的注射材料具有一定的可行性，且其具有安全、有效、操作簡單及并發(fā)癥少等優(yōu)點，將成為注射美容的一種趨勢，值得臨床推廣應(yīng)用。

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[收稿日期]2014-06-10 [修回日期]2014-07-26

編輯/李陽利