周俊立　葉小華　鄒志輝等

摘要：目的 研究香鱗毛蕨醇提取物對紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶的抑制作用， 初步探討其抗真菌作用機制。方法 采用ELISA測定角鯊烯環(huán)氧化酶活性，還原糖法測定β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性。結果 香鱗毛蕨提取物不同濃度組均能降低紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），隨香鱗毛蕨提取物濃度增加，紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性逐漸降低，香鱗毛蕨提取物中濃度組和高濃度組能降低β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002，P=0.000）。結論 香鱗毛蕨提取物抗真菌作用機制可能和角鯊烯環(huán)氧化酶和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性受到抑制有關。

關鍵詞：香鱗毛蕨提取物；紅色毛癬菌；角鯊烯環(huán)氧化酶；β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶

紅色毛癬菌T. rubrum 是臨床常見的皮膚癬菌， 也是淺部真菌病的主要病原菌，是一種在世界范圍內廣泛傳播的病原真菌， 它能引起各種淺表感染， 如頭癬、體癬、股癬、手癬、足癬以及甲癬。紅色毛癬菌是一種專性致病菌，一旦感染紅色毛癬菌則很難根治，在停用抗真菌藥物后會經常復發(fā)[1]。

香鱗毛蕨（Dryopteris fragrans L.）為鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物，生長于海拔1000～1700m的山坡或巖石縫中，用于治療真菌感染的手足癬、體股癬等，療效甚佳，不易復發(fā)[2]。為了探討香鱗毛蕨提取物抗皮膚癬菌的作用機制， 本實驗研究了香鱗毛蕨提取物對紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶活性和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶的影響， 為研究香鱗毛蕨抗真菌作用原理提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1藥物 供試藥材本實驗研究所用的香鱗毛蕨采集于黑龍江省，經鑒定為鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物香鱗毛蕨，香鱗毛蕨提取物采用70% 醇提液，用二甲基亞砜（DMSO）配制成含生藥濃度為625mg/ml的儲存液， 存于-70℃冰箱備用。

1.2菌株 紅色毛癬菌購自中國醫(yī)學科學院皮膚病防治研究所菌種保藏中心。

1.3 主要試劑 真菌角鯊烯環(huán)氧化酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒；真菌細胞β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性定量檢測試劑盒， 美國GENMED SCIENTIFICS INC 產品。

1.4主要儀器 生化培養(yǎng)箱（Forma 3111）， 美國賽默飛世爾科技產品；生物安全柜（Thermo Forma 1389），美國賽默飛世爾科技產品；高速低溫離心機， 德國Eppendorf公司產品；酶標儀（Bio-Rad X mark）， 美國Bio-Rad公司產品；熒光光度計（Thermo Scientific Lumina）， 美國賽默飛世爾科技產品。

2 方法

2.1實驗分組 分空白生長對照組和香鱗毛蕨提取物低、中、高濃度組（香鱗毛蕨70% 醇提液含生藥濃度由低向高依次為62.5，125，250mg/ml）。實驗方法參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）藥物敏感性試驗方案， 將不同濃度的香鱗毛蕨提取物和紅色毛癬菌在25℃孵育7d，然后收集培養(yǎng)物菌絲樣品用于酶活性測定。

2.2 ELISA測定角鯊烯環(huán)氧化酶活性 收集紅色毛癬菌（空白對照組和香鱗毛蕨提取物低、中、高濃度組）培養(yǎng)液， 1000 g離心10 min，分離紅色毛癬菌培養(yǎng)物菌絲，用pH 7. 0的PBS緩沖溶液漂洗3次，1000 g離心10 min，上清棄掉。每組稱取培養(yǎng)物菌絲樣品0.3g，加1 ml PBS緩沖溶液（pH 7. 0），超聲破碎細胞，-20℃放置過夜，第2d反復凍融3次，然后5000g 離心5min，吸取上清，酶活性測定按照ELISA試劑盒說明書進行操作。每組重復實驗3次，計算其酶活性平均值。

2.3β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性測定 本實驗采用還原糖測定法（分光光度法）進行β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性測定。收集5 ml真菌細胞培養(yǎng)液，裂解后按試劑盒說明說進行操作。每組重復實驗3次，計算其酶活性平均值。

2.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理軟件，不同濃度組對酶活性的影響采用單因素方差（ANOVA）分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

3 結果

3.1不同濃度香鱗毛蕨提取物對紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶活性的影響 ANOVA分析，不同濃度組香鱗毛蕨提取物處理后紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶活性差異有統(tǒng)計學意義（F=39.403，P=0.000），表1結果表明，香鱗毛蕨提取物不同濃度組均能降低紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性（差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05），不同濃度組香鱗毛蕨提取物對紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶活性的影響兩兩比較差值均有統(tǒng)計學意義，且圖1結果顯示隨香鱗毛蕨提取物濃度增加，紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性逐漸降低，香鱗毛蕨提取物高濃度組紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性最低。

3.2不同濃度香鱗毛蕨提取物對紅色毛癬菌β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性 ANOVA分析，不同濃度組香鱗毛蕨提取物處理后紅色毛癬菌β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性差異有統(tǒng)計學意義（F=14.521，p=0.001），不同濃度組香鱗毛蕨提取物對紅色毛癬菌β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性的影響兩兩比較結果表明（表2），和對照組相比，香鱗毛蕨提取物低濃度組紅色毛癬菌β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性差異無統(tǒng)計學意義（P=0.200），中濃度組和高濃度組差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002，P=0.000）。

4 討論

香鱗毛蕨是一種重要的藥用植物，有研究發(fā)現(xiàn)，香鱗毛蕨具有顯著的抗皮膚癬菌作用，逐漸地被人們重視[2]，但其抗真菌作用機制目前還不太明確。

麥角甾醇是真菌細胞膜的重要結構成分，在確保膜結構的完整性、生物調節(jié)、細胞活力以及物質運輸?shù)确矫嫫鹬匾饔肹3]。目前臨床最常用的抗真菌藥物主要有兩性霉素B、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和特比萘芬， 它們都是針對真菌細胞膜上的特有脂質麥角甾醇來發(fā)揮其抗真菌作用的[4]。角鯊烯環(huán)氧化酶是真菌細胞膜麥角甾醇生物合成通路中的一個重要酶， 它能使角鯊烯轉變成羊毛甾醇。角鯊烯環(huán)氧化酶如受到抑制， 將導致真菌重要膜成分麥角甾醇生物合成受到抑制，真菌細胞發(fā)生損傷或死亡[5]。本實驗研究結果顯示，香鱗毛蕨提取物不同濃度組均能降低紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性（差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05），隨香鱗毛蕨提取物濃度增加，紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性逐漸降低，香鱗毛蕨提取物濃度高濃度組紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶的活性最低。提示香鱗毛蕨抗真菌機制可能是通過抑制角鯊烯環(huán)氧化酶的活性， 從而影響真菌細胞膜重要成分麥角甾醇的生物合成有一定的關系。

葡聚糖是細胞壁的主要成分， 占細胞干重的48% ～ 60%，β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性如受到抑制，就可致真菌細胞壁結構破壞， 細胞破裂死亡[6]。本實驗研究結果顯示香鱗毛蕨提取物可能對β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性有抑制作用，提示香鱗毛蕨提取物可能通過相應途徑破壞真菌細胞壁起抗真菌作用。

綜上所述，本實驗通過研究香鱗毛蕨不同濃度的提取物對紅色毛癬菌角鯊烯環(huán)氧化酶和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性的影響，結果提示香鱗毛蕨抗真菌機制可能是通過抑制角鯊烯環(huán)氧化酶和β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶的活性， 影響真菌細胞膜重要成分麥角甾醇的生物合成有一定的關系。

參考文獻：

[1]Cotta SR， da Mota FF， Tupinambá G， et al. Antimicrobial activity of Paenibacillus kribbensis POC 115 against the dermatophyte Trichophyton rubrum[J].World J Microbiol Biotechnol，2012，28（3）.

[2]沈志濱，金哲雄，張德連，等.香鱗毛蕨的生藥學研究[J].中草藥，2002，33（7）：661-663.

[3]古力娜.達吾提，斯拉甫.艾白，李治建，等.氣-質聯(lián)用研究地錦草提取物對紅色毛癬菌麥角甾醇的影響[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2010，30（12）.

[4]葉麗娟，王輅，朱輝.抗真菌藥物作用機制及真菌耐藥機制的研究進展[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊，2006，27（5）：221-227.

[5]趙明月，李治建，古力娜·達吾提， 等.地錦草有效部位對紅色毛癬菌羊毛甾醇生物合成的影響[J].中藥藥理與臨床，2012，28（ 3）：142-144.

[6]張影，王東，李興從，等.抗病原真菌藥物的研究進展[J].天然產物研究與開發(fā)，2011，23：983-991.編輯/劉小燕