王穩(wěn)航　徐倩倩　滕安國　劉安軍

摘 要：隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)的非培養(yǎng)鑒定技術(shù)在發(fā)酵肉制品菌群鑒定中得到越來越廣泛的應(yīng)用。其方法主要有種特異性PCR、聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳等。與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定方法相比，非培養(yǎng)方法具有直接、快速、準(zhǔn)確、實時等優(yōu)點，但同時也存在一些缺點，如樣品復(fù)雜程度、DNA（RNA）提取條件、PCR反應(yīng)過程的差異等均可影響鑒定結(jié)果。非培養(yǎng)鑒定技術(shù)與傳統(tǒng)微生物鑒定技術(shù)相結(jié)合，能夠?qū)Πl(fā)酵肉制品菌群多態(tài)性和動態(tài)變化做出準(zhǔn)確的鑒定。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵肉制品；菌群；非培養(yǎng)方法；種特異性聚合酶鏈反應(yīng)；聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳

Culture Independent Methods for Investigating Microbial Ecology of Fermented Meat

WANG Wen-hang， XU Qian-qian， TENG An-guo， LIU An-jun

（College of Food Engineering and Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China）

Abstract： With the rapid development of molecular biological technology， culture independent methods based on polymerase chain reaction （PCR） technology have an increasing application in the identification of microorganisms in fermented meat. The existing culture independent methods mainly include species specific PCR and PCR-denatured gradient gel electrophoresis/temperature gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE/TGGE）. Compared with traditional culture dependent methods， culture independent methods have some advantages such as direct， rapid， accurate and real-time， but also have disadvantages because the results may be influenced by sample complexity， DNA extraction and PCR reaction. The combined application of culture dependent and culture independent methods may provide the best estimation of polymorphism and dynamic changes of microorganisms in fermented meat.

Key words： fermented meat； microorganisms； culture independent methods； species specific polymerase chain reaction （SS-PCR）； polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis/temperature gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE/TGGE）

中圖分類號：Q93.331 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2014）09-0017-05

自1940年開展自然發(fā)酵肉制品菌群的分離鑒定和商業(yè)發(fā)酵劑的研發(fā)以來，發(fā)酵肉制品生產(chǎn)得到了快速發(fā)展。尤其是近幾年來，歐美一些國家（如意大利、西班牙等）發(fā)酵肉制品在肉類制品市場上的份額達(dá)到15%以上，占有舉足輕重的地位。

由于傳統(tǒng)自然發(fā)酵方式存在生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量低、食用安全性差等諸多缺點，加上發(fā)酵肉制品市場需求的不斷增大，利用直接添加發(fā)酵劑工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵肉制品已成為主流。欲制備工業(yè)發(fā)酵劑，首先要對自然發(fā)酵肉制品的菌群進(jìn)行分離、鑒定，尋找對發(fā)酵肉制品品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)的微生物，然后通過人工培養(yǎng)生產(chǎn)工業(yè)發(fā)酵劑，再直接添加于鮮肉中生產(chǎn)發(fā)酵肉制品。另外，對發(fā)酵肉制品生產(chǎn)過程中微生物菌群變化進(jìn)行動態(tài)檢測也是調(diào)控肉制品質(zhì)量的關(guān)鍵。因此微生物鑒定技術(shù)已成為發(fā)酵肉制品生產(chǎn)的重要內(nèi)容。

根據(jù)是否需要對樣品中微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，微生物鑒定技術(shù)可分為培養(yǎng)方法和非培養(yǎng)方法。培養(yǎng)方法鑒定技術(shù)即為傳統(tǒng)的微生物鑒定技術(shù)，是指將待檢樣品轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)基上，模擬待檢微生物的生長條件，待生成單個菌落后，再對其進(jìn)行生理生化、分子生物學(xué)等指標(biāo)的檢測，以確定微生物種類。最近十年的研究不斷證明傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)不能清楚描述發(fā)酵食品的微生物菌群的多樣性，也不能對優(yōu)勢菌群進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)[1]。其主要障礙就是待檢菌種必須進(jìn)行分離純化后，才能進(jìn)行生理生化，如革蘭氏染色、乳酸脫氫酶、過氧化物酶、糖發(fā)酵種類、二氨基庚二酸、產(chǎn)乳酸特性、精氨酸水解能力等相關(guān)檢測實驗。然而理化檢測有時現(xiàn)象不明顯，甚至有時不同菌種之間相互混淆，比如來源于肉制品的彎曲乳桿菌（L. curvatus）和清酒乳桿菌（L. sakei）就不易區(qū)分。雖然聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、核酸探針等分子生物學(xué)技術(shù)可以部分解決這一問題，但分離培養(yǎng)的繁瑣過程費(fèi)時費(fèi)力，一般需要1周以上才能完成，不能對發(fā)酵肉制品發(fā)酵過程的菌相變化進(jìn)行有效的實時監(jiān)控。

培養(yǎng)方法鑒定技術(shù)的另一缺陷是這種方法僅適用于一些容易培養(yǎng)的菌株，而對一些進(jìn)行富集或選擇性培養(yǎng)比較困難的菌株則無法進(jìn)行鑒定[2]。據(jù)估計，自然界中能用于人工培養(yǎng)的微生物種類不超過1%，這也限制了傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定技術(shù)的應(yīng)用[3]。

非培養(yǎng)方法是指不需進(jìn)行待檢微生物的富集或分離，從樣品中直接分離DNA或RNA，再以分子生物技術(shù)手段進(jìn)行分析鑒定來反映微生物菌群多樣性和動態(tài)的一類微生物鑒定技術(shù)[4]。這些技術(shù)主要采用PCR技術(shù)并輔以其他技術(shù)為基礎(chǔ)，在鑒定過程中不需進(jìn)行目標(biāo)菌的分離純化從而避免了人為因素影響，從而更能快速、準(zhǔn)確、科學(xué)地反映發(fā)酵過程中菌群的多樣性、復(fù)雜性和動態(tài)變化，尤其是可對不同微生物之間協(xié)同、拮抗作用以及對發(fā)酵肉制品品質(zhì)的影響進(jìn)行綜合性研究[5]。

經(jīng)過近年來的不斷研究，已發(fā)展了多種以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)的發(fā)酵肉制品非培養(yǎng)鑒定技術(shù)，主要有種特異性PCR、PCR-變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）/溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）等。

1 種特異性PCR

1.1 種特異性PCR技術(shù)原理

PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛用于微生物的鑒定和檢測，其主要以16S rRNA和23S rRNA為擴(kuò)增區(qū)域，通過分析其間差異鑒定微生物種類[6]。但在一些相近的種，如L.sakei和L.curvatus，由于它們的rRNA序列的高度相似性，不能利用此種方法進(jìn)行鑒定，而16S～23S rRNA ITS區(qū)間（inter genic transcribed spacer）序列由于進(jìn)化速度比16S rRNA快10倍以上，不同微生物種間具有較大的堿基差異，因此可用來區(qū)分親緣關(guān)系較近的菌種。這種根據(jù)不同種類微生物基因特定區(qū)間差異設(shè)計特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行微生物鑒定的方法稱為種特異性PCR，其能夠有效、快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行發(fā)酵肉制品菌群的檢測。

1.2 種特異性PCR技術(shù)應(yīng)用

與傳統(tǒng)PCR相比，種特異性PCR更方便、快捷、準(zhǔn)確，交叉感染的機(jī)會大大降低，并且能夠?qū)崿F(xiàn)高通量、寬動態(tài)、自動化[7]。同時，近十年乳酸菌的基因序列的不斷闡明，為種特異性PCR的引物設(shè)計也提供了很大幫助，推動了種特異性PCR的廣泛應(yīng)用。

Aymerich等[8]根據(jù)不同種類微生物設(shè)計了12對引物，利用種特異性PCR技術(shù)鑒定了西班牙Chorizo香腸和Fuet香腸的乳酸菌（LAB）和凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）菌群，并對未富集和富集的2種樣品前處理方法進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不通過培養(yǎng)基富集，直接從發(fā)酵香腸樣品中提取DNA，L.sakei和L.curvatus檢出率為11.8%，植物乳桿菌（L. plantarum）和木糖葡萄球菌

（S. xylosus）檢出率為17.6%。而通過富集后，L. casei和S. xylosus檢出率為100%，屎腸球菌（E. faecium）檢出率為11.8%。原因可能是樣品中含有干擾物質(zhì)，抑制了PCR反應(yīng)，使結(jié)果呈陰性。

Marít等[9]利用螯合型離子交換樹脂Chelex100對發(fā)酵香腸樣品進(jìn)行前處理，并設(shè)計SakF

（5-GATAAGCGTGAGGTCGATGGTT-3）和SakR

（5-GAGCTAATCCCCCATAATGAAACTAT-3）種特異性引物擴(kuò)增16S-23S rRNA ITS區(qū)域，利用種特異性PCR技術(shù)對發(fā)酵香腸的L.casei進(jìn)行了實時動態(tài)計數(shù)。通過螯合型離子交換樹脂Chelex100處理樣品而不進(jìn)行DNA純化，PCR擴(kuò)增結(jié)果表明L.casei檢出下限為3個菌/反應(yīng)，相當(dāng)于3×103 CFU/g樣品，檢測結(jié)果從6×105～32×105個菌/反應(yīng)范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（R2=0.996）。利用這種方法對11 個發(fā)酵香腸樣品中L.casei數(shù)量進(jìn)行檢測，結(jié)果與MRS平皿計數(shù)比較，相對準(zhǔn)確度在91.24%～98.16%之間，統(tǒng)計結(jié)果表明實時PCR計數(shù)與平皿計數(shù)結(jié)果無顯著差異。上述前處理方法與DNA純化方法相比，除樣品所需菌濃較高外，分析并無其他PCR干擾現(xiàn)象發(fā)生，因此這種前處理可有效對發(fā)酵香腸菌群進(jìn)行實時定量。

1.3 種特異性PCR技術(shù)優(yōu)缺點

種特異性PCR的特點是快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)。利用種特異性PCR進(jìn)行微生物鑒定，樣品不需要分離純化，可以在提取DNA（RNA）后直接擴(kuò)增，利用種屬差異性檢測特定條帶，達(dá)到檢測鑒定目的，因而省時省力。另外，根據(jù)種屬差異設(shè)計特定引物，檢測結(jié)果靈敏度、準(zhǔn)確度都較高[10]。

但是，種特異性PCR也存在一些缺陷。首先，種特異性PCR和其他PCR一樣，是以現(xiàn)有基因序列為模板進(jìn)行擴(kuò)增，因此僅適用于已測得基因序列或清楚相關(guān)遺傳信息的微生物的檢測鑒定。同時，由于食品成分復(fù)雜，尤其是一些PCR抑制劑的存在，如蛋白酶、血紅素化合物、螯合劑和蛋白質(zhì)等，均可降低檢測靈敏度。因此，利用種特異性PCR進(jìn)行菌種鑒定必須進(jìn)行樣品預(yù)處理，如樣品稀釋、離心、過濾、雙水相萃取、吸附、DNA純化等方法來消除發(fā)酵香腸中PCR抑制物。另外，采取擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)方法可有效避免不同原因造成種特異性PCR反應(yīng)的假陰性現(xiàn)象[11]。反應(yīng)體系中加入擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)后，擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)可與模板DNA同時擴(kuò)增，若在反應(yīng)體系中目標(biāo)序列的濃度較低或不存在時，應(yīng)該有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，如果PCR反應(yīng)中沒有產(chǎn)生任何擴(kuò)增產(chǎn)物，說明反應(yīng)受到抑制，產(chǎn)生了假陰性，需要重新提取DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。

2 PCR-DGGE/TGGE

2.1 PCR-DGGE/TGGE技術(shù)原理

PCR-DGGE/TGGE技術(shù)最早由Fisher等[12]和Lerman等[13]于1979年提出，是指不同生物DNA特定序列的相同長度PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在各自相應(yīng)變性劑濃度（變性溫度）下發(fā)生空間構(gòu)型變化，導(dǎo)致產(chǎn)生不同的電泳速度，最后在不同相應(yīng)位置停止，并經(jīng)過染色分辨DNA片段差異的電泳技術(shù)。

不同微生物的16S rDNA片段長度相同，但序列變化多樣，在經(jīng)過適當(dāng)變性后，可停留在DGGE譜圖上的不同位置，進(jìn)而根據(jù)DGGE電泳條帶、相關(guān)序列以及16S rDNA基因組資料，從而可以區(qū)分和鑒定不同種類微生物。理論上講，對每一種微生物16S rDNA的可變區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增都會產(chǎn)生一個不同的DGGE圖譜[14-15]，因而可同時檢測多個樣品并可比較不同時間和不同環(huán)境的微生物菌群變化情況。

2.2 PCR-DGGE/TGGE技術(shù)應(yīng)用

隨著1993年Muxzyer等[16]首次將DGGE技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究，PCR-DGGE技術(shù)在環(huán)境生態(tài)、海洋生態(tài)、腸道菌群等領(lǐng)域[17-19]的研究中不斷得到應(yīng)用。最近幾年來，PCR-DGGE技術(shù)開始被逐漸應(yīng)用于發(fā)酵食品微生物研究，如用于監(jiān)測中國鎮(zhèn)江香醋[20]、意大利發(fā)酵玉米團(tuán)[21]、韓國發(fā)酵豆醬[22]和日本大米黑醋[23]等的菌群變化。

Cocolin等[24]利用PCR-DGGE技術(shù)對發(fā)酵香腸的菌群組成及動態(tài)變化做了系列研究。首先，對意大利發(fā)酵香腸菌群動態(tài)變化過程進(jìn)行監(jiān)控。通過直接從發(fā)酵香腸中提取DNA，設(shè)計5對不同引物對16S rRNA的V3、V9、V2-V3、V6-V8、V1、V3等不同區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有P1（5-GCGGCGTGCCTAATACATGC）、P2（TTCCCCACGCGTTACTCACC-3）引物擴(kuò)增的V1區(qū)PCR產(chǎn)物才能對Lactobacillus spp.、Staphylococcus spp.、 Kocuria spp.等不同菌種進(jìn)行有效鑒別，不同種間沒出現(xiàn)共遷移現(xiàn)象。對DGGE濃度的選擇上，發(fā)現(xiàn)40%～60%的變性梯度能進(jìn)行Micrococcaceae和Staphylococcus之間的區(qū)分；而30%～50%的變性梯度能進(jìn)行所有Lactobacillus屬的菌種區(qū)分。在發(fā)酵過程第1天的DGGE譜圖上出現(xiàn)多個條帶，經(jīng)過序列分析，大部分為Staphylococcu spp.，從發(fā)酵第10天開始，僅有LAB條帶出現(xiàn)，而其中以L.sake和L.curvatus為主，表明香腸發(fā)酵過程以LAB為優(yōu)勢菌種，Micrococcaceae屬僅占次要位置。在發(fā)酵香腸中，PCR-DGGE技術(shù)的檢測下限為104 CFU/g樣品。

接著，Cocolin等[25]利用DGGE技術(shù)研究了新鮮發(fā)酵香腸中菌群動態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)香腸成熟第1天，僅有L. curvatus出現(xiàn)，隨后在第3天消失；B. thermosphacta在第2天出現(xiàn)，并貫穿整個成熟過程；S. xylosus僅在第3天出現(xiàn)；第6天檢出了L. casei，并且其在以后成熟期保持?jǐn)?shù)量穩(wěn)定；第10天時檢出了腸膜明串珠菌

（L. mesenteroides）。而以RNA為模板擴(kuò)增所得DGGE條帶比以DNA為模板擴(kuò)增所得DGGE條帶豐富得多，除以上細(xì)菌外，還出現(xiàn)了多種未知菌。同時，以NL1

（5-GCC ATA TCA ATA AGC GGA GGA AAAG-3）和LS2（5-ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC-3）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)了Debaryomyces hansenii和Capronia mansonni等酵母的存在。

Fontanaa等[26]利用Bact-0124f（GC）（5-CACGGATCCGGACGGGTGAGTAACACG-3）-Uni-0515r（5-ATCGTATTACCGCGGCTGCTGCTGGCA-3）引物擴(kuò)增16S rDNA上V2-V3區(qū)域序列，以V3f（GC）（5-CCTACGGGAGGCAGCAG）-Univ-0515r（5-ATCGTATTACCGCGGCTGCTGCTGGCA-3）引物擴(kuò)增V3區(qū)域序列對阿根廷發(fā)酵香腸中菌群進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以40%～60%的變性凝膠梯度濃度進(jìn)行分析結(jié)果較好。擴(kuò)增的V3區(qū)在發(fā)酵開始時，DGGE譜圖上出現(xiàn)了較多條帶，1～6條帶依次被鑒定為L. plantarum、乳酸片球菌（P.acidilactici）、L.casei、L. curvatus、馬胃葡萄球菌（S.equorum）和腐生葡萄球菌（S.saprophyticus），條帶10被鑒定為C.variabilis。微生物檢出下限為104 CFU/g

樣品。

Cocolin等[27]對商用發(fā)酵劑直接發(fā)酵香腸過程中的菌群進(jìn)行檢測。利用DNA為模板對16S rDNA區(qū)間序列進(jìn)行擴(kuò)增，僅發(fā)現(xiàn)L. plantarum和肉葡萄球菌（S.carnosus）存在，而以RNA為模板擴(kuò)增還發(fā)現(xiàn)S.xylosus存在。

2.3 PCR-DGGE/TGGE技術(shù)優(yōu)缺點

PCR-DGGE/TGGE作為一種新興的微生物鑒定技術(shù)，具有耗時少，僅需8 h即可完成，結(jié)果重現(xiàn)性好，不需分離單個菌落等諸多優(yōu)點[28-29]，因而能夠同時鑒定大量發(fā)酵肉制品樣品微生物組成，并可用于監(jiān)測發(fā)酵過程中微生物群落的動態(tài)變化過程，尤其對于一些培養(yǎng)困難或根本不能培養(yǎng)的菌株的鑒定具有很大的應(yīng)用潛力。

但是，PCR-DGGE/TGGE本身也存在著一些技術(shù)缺陷。首先，DGGE/TGGE由于其高分辨率，所分析的DNA片段較小，一般在500個堿基對以下，因此得到的微生物系統(tǒng)信息較少，其次，DGGE/TGGE圖譜中一般只能分辨1～20個條帶，這些條帶大多僅反映微生物群落中的優(yōu)勢菌群，可能只有占總微生物數(shù)量1%以上的種群才能被檢測出來，而弱勢菌群根本不能被檢測到。

另外，樣品菌群的復(fù)雜性、核糖體RNA拷貝數(shù)、提取純化DNA、PCR擴(kuò)增等方面的差異，也會對鑒定結(jié)果產(chǎn)生影響。理論上，同種微生物的DGGE譜圖應(yīng)該僅有單一條帶，但實際上可能會出現(xiàn)多個條帶[30]。造成這一現(xiàn)象除與實驗條件有關(guān)外，rRNA的多態(tài)性也是主要原因之一。同一微生物核糖體基因可能存在多個拷貝，由于這些拷貝呈微觀不均一性，而DGGE技術(shù)的高分辨率，導(dǎo)致其16S rRNA擴(kuò)增呈現(xiàn)多個條帶，因此夸大了微生物菌態(tài)的多樣性[31]。Rantsiou等[32]提出了解決這一問題的方案。編碼RNA聚合酶的β亞基的rpoB基因通常僅有一個拷貝，擴(kuò)增后產(chǎn)物也僅為一條譜帶。其根據(jù)rpoB基因設(shè)計引物擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的DGGE圖譜能夠清楚分辨出Lactobacillus、Lactococcus、Enterococcus、Streptococcus、Leuconostoc和Weisella，因此可用這一基因進(jìn)行復(fù)雜發(fā)酵樣品（如發(fā)酵香腸、奶酪等）微生物菌群的檢測。

3 結(jié) 語

非培養(yǎng)鑒定技術(shù)具有實時、科學(xué)、方便等優(yōu)點，對發(fā)酵肉制品的菌群結(jié)構(gòu)及動態(tài)分析具有很大的潛在應(yīng)用價值，但作為一種新興的鑒定手段，尚未形成統(tǒng)一的方法和程序[33]。一般來說，發(fā)酵肉制品的非培養(yǎng)鑒定技術(shù)的應(yīng)用存在3個關(guān)鍵點：第一，樣品DNA提取。DNA提取是非培養(yǎng)方法研究中的第一步，也是關(guān)鍵的一步，如何高效提取樣品中菌群的DNA顯得至關(guān)重要。DNA提取中混雜雜質(zhì)如蛋白質(zhì)等會干擾PCR反應(yīng)，另外樣品中菌群含量過低，或DNA提取過程中損失較大，均可影響最終PCR反應(yīng)。DNA提取目前沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)步驟，一般均通過實驗根據(jù)不同樣品確定最佳提取條件。第二，特異性引物設(shè)計。根據(jù)不同微生物種類的DNA/RNA特定區(qū)間序列的變化，設(shè)計適宜的引物，對檢測結(jié)果將起到至關(guān)重要的作用。第三，PCR反應(yīng)和DGGE/TGGE反應(yīng)條件的選擇。理論上，DGGE譜圖上每一條帶均代表1個不同的物種，但是，由于PCR反應(yīng)過程中嵌合體、共遷移、異源雙鏈體的存在可能會使實驗結(jié)果產(chǎn)生偏差，因此必須根據(jù)不同目的確定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件。關(guān)于DGGE方法常見問題及解決方案，邢德峰等[34]進(jìn)行了詳細(xì)分析與解析。

非培養(yǎng)鑒定技術(shù)僅適用于已知DNA（RNA）序列和相關(guān)遺傳信息的微生物的快速鑒定，因而不能對未知微生物進(jìn)行檢測，并且無法對發(fā)酵肉制品整個菌群做出系統(tǒng)性分析。因此，非培養(yǎng)方法與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法進(jìn)行結(jié)合使用，更有利于反映出發(fā)酵過程中菌群多樣性的真實信息。

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