褚夫江，劉文彬，朱家勇*

(1.廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州510006；2.廣東藥學院 基礎學院，廣東 廣州 510006)

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噴霧冷凍干燥對家蠅幼蟲活性成分抗菌及抗炎活性影響

褚夫江1,2，劉文彬1,2，朱家勇1,2*

(1.廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東 廣州510006；2.廣東藥學院 基礎學院，廣東 廣州 510006)

以人工飼養(yǎng)繁殖的家蠅(Musca)3齡幼蟲為材料，探討噴霧冷凍干燥對家蠅幼蟲活性提取物抗菌及抗炎活性的影響。結(jié)果表明，經(jīng)噴霧冷凍干燥處理的家蠅幼蟲活性提取物對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌具有有效抑制作用；對LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子TNF-α和IL-6表達具有明顯的抑制作用。

家蠅幼蟲；噴霧冷凍干燥；冷凍干燥；抗菌；抗炎

家蠅隸屬昆蟲綱(Insecta)雙翅目(Diptera)環(huán)裂亞目(Cyclorrhapha)蠅科(Muscidae)家蠅屬(Musca)。其幼蟲蠅蛆含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、甲殼素 、維生素、礦物元素和抗菌肽等多種活性物質(zhì)[1]，是一種非常重要的昆蟲資源，其所特有的抗菌[2]及抗炎[3]活性逐漸引起研究者的重視。隨著蠅蛆養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴大，工廠化養(yǎng)殖為蠅蛆資源的利用奠定了充分的原料基礎。目前，關于蠅蛆的研究開發(fā)利用還處于初級階段，特別是在醫(yī)藥領域中的應用還有待進一步開發(fā)，而有效減少加工過程中蠅蛆體內(nèi)藥用成分的活性缺失成為蠅蛆資源開發(fā)的重點。

在前期的研究中，我們比較了傳統(tǒng)炮制和現(xiàn)代加工方法對蠅蛆抗菌及抗炎活性的影響，結(jié)果表明現(xiàn)代加工工藝能夠有效保護蠅蛆中抗菌及抗炎物質(zhì)的活性[4]。真空冷凍干燥(freeze drying，F(xiàn)D)能有效減少活性缺失，但是此法所需干燥時間長、耗能高，不能滿足規(guī)模化生產(chǎn)的需要。因此，有必要尋求一種更快速的樣品干燥方法。

噴霧冷凍干燥(spray freeze drying， SFD)是近年發(fā)展起來的新型干燥技術，其結(jié)合了噴霧干燥和冷凍干燥兩項技術優(yōu)點[5]。干燥后的物料為粉狀固體，產(chǎn)品原有的生物、化學特性基本不變，易于長期保存，特別適用于熱敏性、黏稠性、活性物料及含糖量高的產(chǎn)品的低溫干燥。本實驗以實驗室人工飼養(yǎng)的家蠅3齡幼蟲為原料，經(jīng)組織勻漿、過濾、離心及超濾離心進行活性成分的提取，采用冷凍干燥及噴霧冷凍干燥技術進行活性成分的制備，研究不同方法所獲產(chǎn)品含水量及體外抗菌、抗炎活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸埃希菌(Escherichia coli)ACCC01309、金黃色葡萄球菌(Staphylococus aureus)ATCC 25923為本實驗室保存。細胞株為鼠源巨噬細胞(Macrophage, Mφ) RAW264.7，購于中山大學細胞與動物實驗中心。種蠅獲贈于廣東省疾病預防與控制中心，雙翅目(Diptera)，蠅科(Muscidae)，蠅屬(Musca)，家蠅(M.domestica)，實驗室自行繁育獲得家蠅3齡幼蟲。籠養(yǎng)方式飼養(yǎng)成蠅，成蠅交配、產(chǎn)卵、孵化，發(fā)育為幼蟲，待幼蟲成長為3齡幼蟲后，采用冷熱刺激的方式進行誘導富集小分子活性成分，收集幼蟲待用。

1.2 工藝流程

3齡幼蟲經(jīng)組織勻漿，過40目紗網(wǎng)，12 000r/min離心10min，收集上清，依次用截留分子量為100KD及30KD超濾膜進行超濾，收集濾液后進行冷凍干燥及噴霧冷凍干燥。

1.3 冷凍干燥制備家蠅幼蟲活性成分

準確量取400.00mL超濾截留液，于-80℃冰箱中速凍3h，轉(zhuǎn)移至多歧管式真空冷凍干燥器中進行干燥，條件：冷阱溫度-60℃、真空度20Pa、干燥時間20h。干燥結(jié)束后，收集產(chǎn)品，準確稱量，獲得產(chǎn)品1，實驗重復3次。

1.4 噴霧冷凍干燥制備家蠅幼蟲活性成分

準確量取400.00mL超濾截留液，檢查儀器氣密性，待儀表顯示穩(wěn)定10min后，設定條件：冷阱溫度-60℃、真空度20Pa、物料溫度-25℃、運行時間8h。干燥結(jié)束后，收集產(chǎn)品，準確稱量，獲得產(chǎn)品2，重復實驗3次。

1.5 含水量測定

方法參照國家藥典2010版附錄ⅨH水分測定法第一法(烘干法)進行。取供試品2.5g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5mm；疏松供試品不超過10mm ；精密稱定，打開瓶蓋在100～105℃干燥5h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30min，精密稱定，再在上述溫度干燥1h，冷卻，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5mg為止。根據(jù)減失的重量，計算供試品中含水量(%)，重復實驗3次。

1.6 抗菌活性檢測

取無菌96孔板，每孔加入濃度為1×106CFU/mL菌液100μL，再分別加入相應濃度的產(chǎn)品1和2 (倍比稀釋：200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.12mg/mL、1.56mg/mL、0.78mg/mL、0.39mg/mL)，同時設立陰性對照組(蒸餾水)、空白組(無細菌)，37℃培養(yǎng)16～20h。每孔加入5μL0.5%氯化三苯四氮唑，37℃培養(yǎng)至無藥物對照組變紅色時終止培養(yǎng)，有細菌生長的孔顯紅色，無細菌生長則不顯色。試驗組無菌生長的最小稀釋度所對應的濃度為最小抑菌濃度(MIC)。將上述未顯色的孔各取培養(yǎng)的混合物100μL，涂布于LB固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜，菌落數(shù)小于5個的平板對應的濃度為最小殺菌濃度(MBC)。

1.7 抗炎活性檢測

巨噬細胞RAW264.7按照1×106cell/mL接種于6孔板，培養(yǎng)24h后，更換為無血清培養(yǎng)基。進行分組處理：正常對照組、LPS處理組(100ng/mLLPS)、實驗處理組[不同濃度的產(chǎn)品1和2：高劑量組(100μg/mL)、中劑量組(40μg/mL)、低劑量組(10μg/mL)+100ng/mLLPS]。各組細胞在不同處理因素作用24h后，收集培養(yǎng)液上清，參照TNF-α、IL-6檢測試劑盒說明書，在酶標儀上測定450nm吸光度，并根據(jù)標準曲線計算相應的濃度。

1.8 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

2 結(jié)果

2.1 不同干燥方法對產(chǎn)品含水量的影響

經(jīng)精確稱量，產(chǎn)品1的質(zhì)量為(3.157±0.115)g，產(chǎn)品2的質(zhì)量為(3.078±0.073)g。影響產(chǎn)品含水量的主要因素為干燥原理和溫度等因素，經(jīng)測定產(chǎn)品1的含水量為(3.45±0.98)%，產(chǎn)品2的含水量為(2.14±0.42)%，兩種干燥方法所獲產(chǎn)品的含水量均小于5%。

2.2 不同干燥方法對產(chǎn)品抗菌活性的影響

以常見代表性的革蘭氏陽性菌(G+)金黃色葡萄球菌及革蘭氏陰性菌(G-)大腸埃希菌作為試驗菌，采用微量肉湯稀釋法測定產(chǎn)品1和產(chǎn)品2對這些菌株的最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)。結(jié)果顯示，產(chǎn)品1和產(chǎn)品2對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均具有一定的抑制作用，其中，相對產(chǎn)品1，產(chǎn)品2對大腸埃希菌的抑制作用更為顯著。見表1。

表1 不同干燥方法對家蠅幼蟲活性成分抑菌活性的影響

2.3 不同干燥方法對產(chǎn)品抗炎活性的影響

相對LPS處理組，產(chǎn)品1和產(chǎn)品2均能有效抑制巨噬細胞TNF-α、IL-6的表達，且抑制效果具有一定的劑量依賴性。在同等劑量條件下，產(chǎn)品2能夠更顯著地降低TNF-α、IL-6水平。相對陰性對照組，在低劑量條件下，產(chǎn)品2對TNF-α的降低效率達20%以上，而產(chǎn)品1則降低12%左右；高劑量條件下，產(chǎn)品2對TNF-α的降低效率達70%以上，產(chǎn)品1則降低67%左右。產(chǎn)品1和產(chǎn)品2對IL-6表達的影響也具有同樣的趨勢。見表2。

3 討論

蠅蛆的藥用價值主要集中在蠅蛆體內(nèi)免疫活性物質(zhì)的開發(fā)。研究表明，蠅蛆能分泌多種抗菌活性物質(zhì)，具有抑菌、促進傷口愈合及殺傷癌細胞等功能[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，家蠅幼蟲體內(nèi)的小分子活性成分具有改善動物動脈粥樣硬化，減輕炎癥反應的作用[7-8]。而如何在放大生產(chǎn)過程中最大限度地保持家蠅幼蟲有效成分的活性成為蠅蛆資源開發(fā)的關鍵。為此，我們就冷凍噴霧干燥對蠅蛆活性成分抗炎及抗菌活性的影響進行了初步研究。

表2 不同干燥方法對家蠅幼蟲活性成分抗炎活性的影響 ±s，n=6)

注：與本產(chǎn)品陰性對照組比較，##P< 0.01 ；與產(chǎn)品1對應劑量組比較，**P< 0.01。

含水量是檢驗干燥效果的重要指標之一。結(jié)果表明，冷凍干燥和噴霧冷凍干燥均能有效去除產(chǎn)品中的水分，且含水量均在5%以下，其中噴霧冷凍干燥所獲產(chǎn)品的含水量低于冷凍干燥所獲產(chǎn)品，主要原因是噴霧冷凍干燥增大了干燥面積，能夠更有效地提高干燥效率[9]。有效去除產(chǎn)品中的水分后，產(chǎn)品的活性有何影響呢？我們就兩種方法所獲產(chǎn)品的抗菌及抗炎活性進行了比較，結(jié)果顯示，兩種方法所獲產(chǎn)品對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均具有一定的抑制作用。其中，噴霧冷凍干燥方法所獲產(chǎn)品對大腸埃希菌的抑制作用更為顯著；兩種方法所獲產(chǎn)品均具有明顯抗炎效果，其中噴霧冷凍干燥所獲產(chǎn)品的抗炎作用更顯著。在針對不同干燥方法對葛仙米藻蛋白抗氧化特性影響的研究中，也同樣證實噴霧冷凍干燥能夠更好地保持提取物的活性[10]。

綜上所述，噴霧冷凍干燥能夠有效去除家蠅幼蟲活性成分中的水分，同時能有效保持活性成分的抗菌及抗炎活性，是一種可用于規(guī)模化開發(fā)蠅蛆資源的理想干燥技術。

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(責任編輯：宋勇剛)

Effects of Spray Freeze Drying on Antibacterial and Anti-inflammatory Activity of Housefly Larvae

Chu Fujiang1,2,Liu Wen bin1,2,Zhu Jiayong1,2*

(1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances, Guangzhou 510006, China; 2.School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China)

Three instar larvae of housefly (Musca) which harvested by captive breeding was taken as raw materials. The effects of spray freeze drying on antibacterial and anti-inflammatory activity of housefly larvae were investigated. And the results showed that the extract of housefly larvae which was treated by spray freeze drying had the function of inhibiting the Staphylococcus aureus and Escherichia coli. And also the expression of TNF-α and IL-6 of macrophage which induced by LPS were inhibited when treated with the extract of housefly larvae.

Housefly Larvae; Spray Freeze Drying; Freeze Drying; Antibacterial; Anti-inflammatory

2014-03-17

國家自然科學基金項目(81274061)；廣東省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)核心技術攻關項目(2012A080800016)；廣東省醫(yī)學科研基金項目(B2013189)；廣東省自然科學基金(S2013040014444)；廣東省高等學校學科與專業(yè)建設專項資金項目(2013LYM0045)

褚夫江(1980-)，男，博士，廣東省生物活性藥物研究重點實驗室助理研究員，研究方向為生物活性藥物的結(jié)構(gòu)與功能。

朱家勇(1954-)，男，廣東藥學院教授，研究方向為生物活性藥物的結(jié)構(gòu)與功能。

R282.74

A

1673-2197(2014)13-0006-03