蒙滋滋　鐘國(guó)強(qiáng)　涂榮會(huì)　何艷　黎慶捷　李爍

【摘要】 目的 研究L型鈣通道β2亞基在心房顫動(dòng)中的表達(dá)變化。方法 收集42例行風(fēng)濕性心臟病瓣膜置換術(shù)患者右心房組織作為標(biāo)本， 其中慢性心房顫動(dòng)患者22例， 竇性心律患者20例， 分別作為慢性心房顫動(dòng)組和竇性心律組。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)L型鈣通道β2亞基的mRNA表達(dá)， 以及用Western Blot方法檢測(cè)L型鈣通道β2亞基的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與竇性心律組比較， 慢性心房顫動(dòng)組中L型鈣通道β2亞基在mRNA及蛋白水平的表達(dá)則均較竇性心律組顯著上調(diào)（P<0.05）。結(jié)論 慢性心房顫動(dòng)組心房組織中L型鈣通道β2亞基的表達(dá)上調(diào)， 從而影響心房顫動(dòng)的發(fā)生和維持。

【關(guān)鍵詞】 L型鈣通道β2亞基；心房顫動(dòng)；右心房組織

心房顫動(dòng)（房顫）是臨床上最常見(jiàn)的心律失常之一， 目前房顫的作用機(jī)制尚不清楚。因此， 積極尋找新的靶點(diǎn)對(duì)臨床房顫的防治十分重要。L型鈣通道β2亞基（CACNB2）在人心肌中表達(dá)[1]， 并對(duì)房顫的發(fā)生有著密切聯(lián)系[2]， 但是目前關(guān)于CACNB2的研究較少， 本文就CACNB2在心房顫動(dòng)中的mRNA及蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行研究， 探討其表達(dá)變化在房顫中的影響。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選擇于2012年8月～2013年5月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科住院行風(fēng)濕性心臟病瓣膜置換術(shù)的患者42例， 其中房顫患者22例（房顫病史>6個(gè)月）， 竇性心律（竇律）患者20例， 分別作為慢性房顫（CAF）組和正常竇律（NSR）組。所選病例年齡、性別、手術(shù)方式并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。病例選擇排除標(biāo)準(zhǔn)：①口服鈣離子拮抗劑患者；②有感染性心內(nèi)膜炎；③臨床上有風(fēng)濕性活動(dòng)征象；④年齡>55歲或<18歲。⑤患有糖尿病， 嚴(yán)重肝腎疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病。

1. 2 標(biāo)本采集和保存 所選病例于體外循環(huán)建立時(shí)取約100 mg右心房組織放入無(wú)RNA酶的凍存管中并迅速置于液氮中保存。

1. 3 主要試劑 Trizol（invitrogen）， 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermantas#k 1622）， 一抗（Santa Cruz， sc-81890）， 二抗（北京中彬金橋， ZB-2305）， 內(nèi)參抗體（上?？党缮锕荆?KC-5G5）。

1. 4 實(shí)驗(yàn)方法

1. 4. 1 qRT-PCR檢測(cè) ①取約50 mg右心房組織加入Trizol試劑中勻漿提取總RNA， 并將提取好的RNA溶解于DEPC水中， 于紫外分光光度儀測(cè)定濃度和OD值， 所有樣本總RNA的OD值均在1.8～2.0范圍內(nèi)。將總RNA按Fermantas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒#k1622說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。②引物由上海生工生物有限公司代為設(shè)計(jì)合成CACNB2 Forward primer：5'-ATGCGAGCAGGACGTCGA-3'，CACNB2 Reverse primer：5'-TTAGAGCGGCTCCACTTGG-3'；β-actin Forward primer：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'；β-actin Reverse primer：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。③qRT-PCR檢測(cè)：使用SYBR Green 1染料法進(jìn)行相對(duì)定量。qRT-PCR使用儀器為美國(guó)AB7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。CACNB2及β-actin反應(yīng)條件：95°變性10 min， 95°變性15 s， 58°退火45 s， 72°延伸30 s， 共40個(gè)循環(huán)， 72°延伸10 min。④根據(jù)目的和內(nèi)參所得的Ct值， 用內(nèi)參做標(biāo)準(zhǔn)化處理， 計(jì)算2-△△ct值以進(jìn)行相對(duì)定量， 計(jì)算所得值用相對(duì)于竇律組表達(dá)的倍數(shù)來(lái)表示。

1. 4. 2 Western Blot檢測(cè) ①取約50 mg右心房組織放入RIPA裂解液中， 并加入蛋白酶抑制劑后進(jìn)行勻漿。提取總蛋白后， 用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。②取等量蛋白上樣進(jìn)行電泳（10%分離膠， 5%濃縮膠）， 用0.45 mmPVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜， 5%TBST牛奶封閉， 目的一抗及內(nèi)參GAPDH孵育過(guò)夜， 二抗孵育1 h。③為了校正上樣量及曝光時(shí)間造成的差異， 顯影時(shí)采用GAPDH作為內(nèi)參， 每個(gè)條帶均同時(shí)檢測(cè)GAPDH的表達(dá)量。各條帶CACNB2的相對(duì)表達(dá)量為CACNB2灰度值/GAPDH的灰度值。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有計(jì)量資料用（ x-±s）表示， 用SPSS16.0軟件， 兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)， P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 CACNB2的qRT-PCR結(jié)果 組間CACNB2的比較， 慢性房顫組較正常竇律組明顯上調(diào)[（1.9783±0.3231）VS （0.7215±0.4021）， P<0.05]， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2. 2 CACNB2的Western Blot結(jié)果 經(jīng)過(guò)軟件獲取條帶的灰度值， 計(jì)算目的條帶與內(nèi)參條帶GAPDH的灰度值之比， 進(jìn)行相對(duì)半定量分析， CACNB2在房顫組中蛋白表達(dá)顯著高于正常竇律組[（1.35±0.20）VS（1.07±0.23）， P<0.05]。結(jié)果如圖1所示， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

心房顫動(dòng)是常見(jiàn)的心律失常之一， 目前發(fā)病機(jī)制尚未清楚。近年研究表明， 心房顫動(dòng)與心房肌的有效不應(yīng)期縮短有關(guān)[3]， 主要為動(dòng)作電位2期平臺(tái)期的縮短， 而此期ICaL作為與鉀離子通道電流拮抗的電流[4]， 在心房顫動(dòng)中起重要作用。風(fēng)濕性因素對(duì)于L型鈣通道的表達(dá)無(wú)直接影響 。Yue等在房顫犬模型的研究中提出IcaL降低[5]， 此后亦有不少文獻(xiàn)作相關(guān)報(bào)道。對(duì)慢性房顫的研究中， 目前鈣超載是房顫的發(fā)生和維持的主要機(jī)制之一， 是電重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)[6]。L型鈣通道在鈣電流變化中起重要作用。L型鈣通道β亞基有四種亞型， 只有β2亞基在心肌表達(dá) [1]。本研究通過(guò)RT-PCR和Western Blot可知， 房顫組mRNA及蛋白表達(dá)高于竇律組， 即CACNB2表達(dá)發(fā)生了上調(diào)， 此結(jié)果與Schotten的報(bào)道相似。Schotten等[7]研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)性房顫患者心肌L型鈣通道β2a亞基的表達(dá)并不下調(diào)， 所以， 房顫時(shí)IcaL降低可能與其他亞基或者亞型的下調(diào)或表達(dá)異常有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究的是慢性房顫患者右心耳組織中L型鈣通道β2亞基的表達(dá)， 而在既往的研究中鮮有相關(guān)報(bào)道。endprint

CACNB2表達(dá)發(fā)生上調(diào)， 可使L型鈣通道活性增強(qiáng)， 加速L型鈣通道激活， 增加鈣電流，促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增高， 發(fā)生了鈣超載， 導(dǎo)致L型鈣通道本身加速失活， IcaL降低， 有效不應(yīng)期縮短， 促進(jìn)房顫的發(fā)生[8]。而L型鈣通道的失活不僅與膜電位有關(guān)， 還與細(xì)胞內(nèi)鈣濃度相關(guān)[9]， 房顫時(shí)快速心房率會(huì)進(jìn)一步加劇細(xì)胞內(nèi)鈣超載， 引起細(xì)胞內(nèi)L型鈣通道其他亞基和其他鈣通道的表達(dá)和功能的改變， 進(jìn)而維持房顫的發(fā)生[5]。

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CACNB2表達(dá)發(fā)生上調(diào)， 可使L型鈣通道活性增強(qiáng)， 加速L型鈣通道激活， 增加鈣電流，促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增高， 發(fā)生了鈣超載， 導(dǎo)致L型鈣通道本身加速失活， IcaL降低， 有效不應(yīng)期縮短， 促進(jìn)房顫的發(fā)生[8]。而L型鈣通道的失活不僅與膜電位有關(guān)， 還與細(xì)胞內(nèi)鈣濃度相關(guān)[9]， 房顫時(shí)快速心房率會(huì)進(jìn)一步加劇細(xì)胞內(nèi)鈣超載， 引起細(xì)胞內(nèi)L型鈣通道其他亞基和其他鈣通道的表達(dá)和功能的改變， 進(jìn)而維持房顫的發(fā)生[5]。

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CACNB2表達(dá)發(fā)生上調(diào)， 可使L型鈣通道活性增強(qiáng)， 加速L型鈣通道激活， 增加鈣電流，促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增高， 發(fā)生了鈣超載， 導(dǎo)致L型鈣通道本身加速失活， IcaL降低， 有效不應(yīng)期縮短， 促進(jìn)房顫的發(fā)生[8]。而L型鈣通道的失活不僅與膜電位有關(guān)， 還與細(xì)胞內(nèi)鈣濃度相關(guān)[9]， 房顫時(shí)快速心房率會(huì)進(jìn)一步加劇細(xì)胞內(nèi)鈣超載， 引起細(xì)胞內(nèi)L型鈣通道其他亞基和其他鈣通道的表達(dá)和功能的改變， 進(jìn)而維持房顫的發(fā)生[5]。

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