孫冰冰，段紅英，李偉，魏軍，田濤*

(1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，天津 300381;2.天津市西青區(qū)植物保護(hù)站，天津 300380)

辣椒疫病，是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的一種毀滅性的土傳病害，在全球范圍內(nèi)的熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)的露地和保護(hù)地均有發(fā)生［1－2］。我國自從50年代在江蘇報道此病的發(fā)生后，其發(fā)生和為害有逐漸加重的趨勢，常導(dǎo)致植株成片死亡，發(fā)病地塊一般病株率為20%左右，嚴(yán)重的達(dá)到80%以上［3］。目前尚無對辣椒疫病有效防治的抗病品種，生產(chǎn)上防治主要是以化學(xué)藥劑為主。但由于長期大量使用殺菌劑，P.capsici已對大多數(shù)常用農(nóng)藥品種產(chǎn)生了不同程度的抗藥性［4］。另外，由于土壤吸附和微生物降解作用，使用化學(xué)農(nóng)藥防治辣椒疫病效果不佳。由于該病的循環(huán)周期非常短(僅3～5 d)，病害的傳播速度也非常快。這些原因造成生產(chǎn)中化學(xué)農(nóng)藥的大量、高頻使用，帶來嚴(yán)重的環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留問題［5］。

由于利用自然界有益微生物防治土傳病害具有安全性和有效性方面所具有的天然優(yōu)勢，因此利用有益微生物對辣椒疫病進(jìn)行生物防治成為重要的研究方向。我國已報道的生防菌主要有芽孢桿菌、放線菌、木霉、曲霉等［1－3，5－8］。國外有 Quantum 4000、BIBAB－T、AmniteA－100、Biologic－SC27 等細(xì)菌類和真菌類生防產(chǎn)品作為殺菌劑或生物肥料注冊登記［5］。本研究中，利用了單一靶標(biāo)初篩－多靶標(biāo)復(fù)篩－室內(nèi)生測的篩選體系從來自全國多個地區(qū)的根際土壤中篩選出對辣椒疫病防病效果達(dá)到70%以上的6個候選生防菌株，其中TB1340防效達(dá)到82%。結(jié)合16S rRNA基因序列測序鑒定和形態(tài)學(xué)觀察，TB1340被初步鑒定為Bacillus sp.。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、培養(yǎng)基及辣椒品種

辣椒疫霉(Phytophtora capsici)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)及瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)為天津市植物保護(hù)研究所植物病害生物防治研究室保存。

LB培養(yǎng)基用于拮抗細(xì)菌的分離培養(yǎng)。PDA培養(yǎng)基用于4種病原菌的培養(yǎng)以及拮抗細(xì)菌的篩選。幾丁質(zhì)培養(yǎng)基(膠狀幾丁質(zhì) 15 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO40.7 g，KH2PO40.3 g、瓊脂20 g，定容至1000mL，pH值7.0～7.2)用于幾丁質(zhì)酶的檢測。纖維素酶培養(yǎng)基(蛋白胨10 g，酵母粉5 g，羧甲基纖維素鈉10 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，瓊脂20 g，定容至1000mL，pH 值 7.0)用于纖維素酶的檢測。β－1，3－葡聚糖酶培養(yǎng)基(蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 5 g，剛果紅 0.04g，瓊脂 20 g，定容至 1000mL，pH 值7.0)

供試?yán)苯菲贩N:紅線椒8819(對辣椒疫病中等抗性)，天津科潤種業(yè)有限公司提供。

1.2 拮抗細(xì)菌的分離、純化與保存

從天津、河北、山東、山西、福建、河南及江蘇等全國多個地區(qū)采集土樣56份(選取植物根圍1～2 mm土壤)，采用土壤稀釋法于LB培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)細(xì)菌，選擇合適的稀釋濃度(每個平皿出現(xiàn)大約200個菌落)。從每個平皿上選擇10個左右菌落形態(tài)有差異的菌株經(jīng)平板劃線純化，轉(zhuǎn)移到加20%甘油的EP管里面，－20℃保存。

1.3 拮抗細(xì)菌的篩選

采用平板對峙法，用直徑7 mm的打孔器取生長旺盛的病原菌菌餅轉(zhuǎn)接于PDA平板中央，視病原真菌生長速度選擇合適時期接種分離到的細(xì)菌(腐霉和立枯絲核菌與細(xì)菌同時接種，疫霉和灰霉待菌絲擴(kuò)增1 cm后再接種待測細(xì)菌)。接種時用高溫滅菌的牙簽蘸取分離到的細(xì)菌，等距離(距離病原菌3 cm處)對稱點(diǎn)接到PDA平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)，待對照皿中真菌菌絲即將長滿皿時測量抑菌圈大小，根據(jù)抑菌圈大小篩選出對病原菌具有較強(qiáng)拮抗作用的菌株。

1.4 室內(nèi)防治效果測定

選擇大小均勻的辣椒種子經(jīng)消毒后，用滅菌水浸泡4 h，于28℃催芽播種至露白。然后用含有1.0×108cfu/mL待測菌懸液浸種45 min。將4粒種子放入裝有滅菌土的營養(yǎng)缽里，待幼苗長至3～4葉期時留兩株長勢均勻的幼苗，每個處理20盆，3次重復(fù)。將病原菌P.capsici用CA培養(yǎng)基在25℃培養(yǎng)10 d后，誘導(dǎo)出游動孢子，用無菌水將游動孢子濃度調(diào)整為1.0×105cfu/mL。在距離植株3 cm處將5mL游動孢子懸浮液注入植株根部。置于28℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于7、14、21 d后調(diào)查植株萎蔫或死苗情況(病株數(shù))［9］。

1.5 菌株生物學(xué)特性測定

幾丁質(zhì)酶活性檢測:將待測菌株接種在含有膠體幾丁質(zhì)的幾丁質(zhì)酶檢測培養(yǎng)基［10］上，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后，在4℃放置7 d后檢測菌落邊緣形成的透明圈寬度。纖維素酶活性檢測:將待測菌株接種在含有羧甲基纖維素鈉的纖維素酶檢測培養(yǎng)基［11］上，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后，在25℃放置1 d后經(jīng)染色處理，觀測在菌落邊緣是否形成透明圈及其寬度。β－1，3－葡聚糖酶活性檢測:將待測菌株接種在含有剛果紅的葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基［12］上，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后，在25℃放置1 d后，觀察菌落周圍的培養(yǎng)基顏色變化。

1.6 菌株分類地位的16S rRNA序列測定

按常規(guī)小量細(xì)菌基因組提取方法提取制備樣品［13］，根據(jù)細(xì)菌16S rRNA基因序列的保守區(qū)域設(shè)計引物:16sF－AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT 和 16sR－TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC。 把 用PCR擴(kuò)增得到的片段連接到 pUC－T載體(康為世紀(jì))，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli DH5α菌株，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，送金唯智生物科技公司進(jìn)行序列測定。將得到的序列與其他細(xì)菌來源的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(MEGA)，分析其親緣關(guān)系。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用DPS軟件中的Duncan′s新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌的分離與初步篩選

依照材料與方法所述，從來源于全國各地的56份樣品中分離菌株，建成庫容為10000株的菌株資源庫。以P.capsici為靶標(biāo)進(jìn)行平板拮抗實驗，初步得到802株對P.capsici具有拮抗作用的生防菌候選菌株，其抑菌圈寬度為2～16 mm。用初篩得到的菌株對R.solani、B.cinerea及P.aphanidermatum進(jìn)行平板拮抗試驗，得到62株對4種病原真菌均具有較好拮抗作用或?qū)?種具有很強(qiáng)拮抗作用的候選生防菌株(表1)，命名為 TB－1301 ～TB－1362。

表1 候選生防菌株對4種植物病原真菌的拮抗能力測定Table 1 Antagonistic capability determination of biocontrol candidates against four kinds of phytopathogenic fungi

續(xù)表1

2.2 室內(nèi)盆栽測定對辣椒疫病防治效果

從62株候選生防菌中挑選出對4種病原菌均具有良好拮抗效果的29個菌株進(jìn)行室內(nèi)盆栽試驗，以測定其對辣椒疫病的防治效果。在接種病原菌后7、14和21 d調(diào)查植株發(fā)病情況，結(jié)果表明在既不接種病原菌也不接種生防菌的處理中(CK1)，沒有植株發(fā)病;在只接病原菌，不接種生防菌的處理中(CK2)，植株全部發(fā)病;在同時接種病原菌和生防菌的各個處理與CK2相比，其發(fā)病率均在不同程度表現(xiàn)出下降的趨勢，在21 d后菌株TB1307、TB1308、TB1314、TB1340、TB1344和TB1358相對防治效率仍達(dá)到70%以上，其中菌株TB1340防效最好，在接種病原菌后7、14和21 d調(diào)查，其相對防效分別為100%、90%和82%(表2)。

表2 拮抗菌株對辣椒疫病盆栽的防治效果Table 2 Control effects of antagonistic strain against pepper phytophthora blight in pot experiment

續(xù)表2

2.3 菌株TB1340基本生物學(xué)特性

菌株TB1340在LB固體培養(yǎng)基上經(jīng)37℃培養(yǎng)16 h后，經(jīng)肉眼觀察其菌落為圓形，中間稍微隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤，呈白色半透明狀(圖1A);將菌株TB1340接種在含有膠體幾丁質(zhì)的幾丁質(zhì)酶檢測培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后，在4℃放置7 d后在菌落邊緣形成寬度約3 mm的透明圈(圖1B);將菌株TB1340接種在含有羧甲基纖維素鈉的纖維素酶檢測培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后，在25℃放置1 d后經(jīng)染色處理，在菌落邊緣觀測到寬度約20mm的透明圈(圖1C);將菌株TB1340接種在含有剛果紅的葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后，在25℃放置1 d后，在菌落周圍的培養(yǎng)基顏色明顯變淺(圖1D);

圖1 菌株TB1340基本生物學(xué)特性Fig.1 The basic biological characteristics of strain TB1340

2.4 菌株TB1340種屬16S rRNA基因序列測定

將菌株TB1340提取基因組DNA后，擴(kuò)增其16S rRNA基因序列，測序并將TB1340的16S rRNA基因序列上傳 GenBank，其 GenBank登錄號為 KJ501094。序列比對分析表明，該菌和解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens菌株Hk8－20以及枯草芽孢桿菌B.subtilis菌株CZB13同源性最高，達(dá)到97.89%。另外，與菌株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus相比其同源性也達(dá)到97.08%。將菌株TB1340的16S rRNA基因序列與高同源性的B.amyloliquefaciens、B.subtilis的序列以及花域芽孢桿菌B.vallismortis、魯菲不動桿菌Acinetobacter lwoffii、蠟樣芽孢桿菌B.cereus等菌株的序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。菌株TB1340與12株B.amyloliquefaciens、3株 B.subtilis及2株B.methylotrophicus聚在一起形成1個分支。結(jié)合菌株TB1340的16S rRNA基因序列測定和其形態(tài)特征(圖1A)，將其確定為Bacillus sp.，但最終分類地位仍需進(jìn)一步生理生化驗證。

圖2 菌株TB1340的16S rRNA區(qū)域的進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of 16S rRNA area of strain TB1340

3 討論

我國幅員遼闊，不同的地方氣候條件和地形地貌差異較大，造就了豐富的微生物資源。如何更好地開發(fā)和利用自然界中的有益微生物防治植物病害是一個重要的科學(xué)問題。為了更為高效地篩選植物病害生物防治菌株，科研工作者進(jìn)行了多種嘗試。有研究者利用分子生物學(xué)和生物化學(xué)手段建立高通量的篩選體系［14－16］;有研究者采取從沙漠、高原、極地和灘涂篩選生防菌株的策略［2，11，16］。在本研究中，為了發(fā)掘我國的微生物資源，并且從微生物和植物互作的角度考慮，采用了從多個省份選取長勢較好的農(nóng)作物根圍分離和篩選生防菌株的策略，建立了庫容為10000株的微生物資源庫。以P.capsici為靶標(biāo)，利用平板拮抗的方法從中篩選出802株對P.capsici具有較好拮抗效果的菌株。

與化學(xué)藥劑相比，植病生防產(chǎn)品在防治范圍上較窄，這是影響植物病害生物防治產(chǎn)品推廣的一個限制性因素。為了盡可能地獲得較為廣譜的候選生防菌株，同時出于減少在防病效果生物學(xué)測定的工作量考慮，又以R.solani、B.cinerea及P.aphanidermatum為靶標(biāo)對候選生防菌株的拮抗能力進(jìn)行檢測，確定了62株對4種病原真菌具有較強(qiáng)拮抗能力或?qū)?種真菌具有很強(qiáng)拮抗能力的菌株。經(jīng)溫室盆栽實驗測定，有6株候選菌株防效達(dá)到70%以上，其中TB1340菌株防效達(dá)到82%，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但是其田間使用效果以及對其他病害的防治效果尚需進(jìn)一步地驗證。

生防菌所產(chǎn)生的抗生素類、脂肽類、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和β－1，3葡聚糖酶等物質(zhì)是其抑菌和防病的關(guān)鍵因子［10，17］，幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和 β－1，3 葡聚糖酶是多種芽孢桿菌類生防菌株的關(guān)鍵生防因子［10，12］。用幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和β－1，3葡聚糖酶鑒別培養(yǎng)基檢測菌株TB1340產(chǎn)酶情況時，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生這3種酶的能力都比較強(qiáng)(圖1)。將菌株TB1340產(chǎn)酶能力和其廣譜的抑菌能力相聯(lián)系，我們進(jìn)一步思考:(1)如何將幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和β－1，3葡聚糖酶作為指標(biāo)，納入科學(xué)的篩選評價體系從而提高生防菌的篩選效率;(2)這3種酶對菌株TB1340針對不同的病原真菌的拮抗和生防能力的貢獻(xiàn)是否相同，如果不同，這種差異具有怎樣的普遍規(guī)律。這些有待于進(jìn)行更加深入地研究。

［1］李美榮，劉永鋒，聶亞鋒，等.辣椒疫病拮抗菌的分離、篩選與評價［J］.長江蔬菜學(xué)術(shù)版，2009(10):60－64.

［2］蔡艷，薛泉宏，陳占全，等.青海高原東部土壤辣椒疫霉生防菌的初步篩選［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，16(2):241－244.

［3］劉暢.辣椒疫病生物防治的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報，2009，15(19):99－101.

［4］王進(jìn)強(qiáng)，許文耀，吳剛.辣椒疫病防治劑的室內(nèi)篩選［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，23(1):113－117.

［5］徐劉平，郭堅華.生防菌NJ02防治辣椒疫霉病效果及對辣椒根圍微生物群落的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(1):59－62.

［6］吳石平，袁潔，楊學(xué)輝，等.幾種殺菌劑對辣椒疫病的抑菌活性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(1):211－212.

［7］楊琦瑤，索雅麗，郭榮君，等.枯草芽孢桿菌B006對黃瓜枯萎病菌及辣椒疫霉病菌的抑制作用及其抗菌組分分析［J］.中國生物防治學(xué)報，2012，28(2):235－242.

［8］易龍，肖崇剛，張迎芳，等.辣椒疫病拮抗放線菌的篩選及防治試驗初報［J］.中國蔬菜，2009(12):28－32.

［9］鄒學(xué)校.中國辣椒［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

［10］石磊，杜錦錦，郭慶港，等.具分泌幾丁質(zhì)酶活性的生防細(xì)菌的篩選鑒定及幾丁質(zhì)酶基因的克隆和表達(dá)［J］.植物病理學(xué)報，2013，43(2):149－156.

［11］穆春雷，武曉森，李術(shù)娜，等.低溫產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選、鑒定及纖維素酶學(xué)性質(zhì)［J］.微生物學(xué)通報，2013，40(7):1193－1201.

［12］劉曉玲，王金晶，李永仙，等.產(chǎn) β－1，3－1，4－葡聚糖酶特基拉芽孢桿菌 Bacillus tequilensis CGX5－1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2013，32(6):645－650.

［13］薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆實驗指南［M］.3版.北京:科學(xué)出版社，2002.

［14］劉國紅，劉波，林乃銓.青枯雷爾氏菌生防芽胞桿菌的快速篩選及其鑒定中國生物防治學(xué)報［J］.2013，29(3):473－480.

［15］郭堅華，王玉菊，李瑾，等.抑菌圈－定殖力雙重測定法篩選青枯病生防細(xì)菌［J］.植物病理學(xué)報，1996，26(1):49－54.

［16］田濤，孫淑琴，楊秀榮，等.植物病害生防細(xì)菌的篩選策略［J］.天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，18(5):162－165.

［17］TIAN T，WU X G，DUAN H M，et al.The resistance－nodulation－division efflux pump EmhABC influences the production of 2，4－diacetylphloroglucinol in Pseudomonas fluorescens 2P24［J］.Microbiology，2010，156(1):39 －48.