亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        新德里金屬β內(nèi)酰胺酶-1序列和抗藥性的生物信息學(xué)分析

        2014-04-23 05:19:32程琪溫權(quán)胡小林徐真昊廖智宇趙一雷
        生命科學(xué)儀器 2014年6期
        關(guān)鍵詞:進(jìn)化樹內(nèi)酰胺酶環(huán)素

        程琪,溫權(quán),胡小林,徐真昊,廖智宇,趙一雷,

        (1. 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海,200240;2. 上海中學(xué),上海,200231)

        近年來,β-內(nèi)酰胺類抗生素(beta-lactam antibiotics)在臨床及農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用,是細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)的原因之一,其中產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶(beta-lactamase)水解該類抗生素是細(xì)菌耐藥的重要機(jī)制之一[1]。根據(jù)Ambler分類法,β-內(nèi)酰胺酶分為A/B/C/D四類,其中,A/C/D三類通過活性位點(diǎn)的絲氨酸殘基來催化水解;而B類β-內(nèi)酰胺酶為金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL, metallo-beta-lactamase),其活性位點(diǎn)需要一個(gè)或兩個(gè)金屬離子協(xié)助催化水解[2]。MBL可以催化水解除單環(huán)外的所有β-內(nèi)酰胺酶,且對(duì)常規(guī)的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑有抵制作用。金屬酶編碼的耐藥基因位于細(xì)菌染色體、質(zhì)?;蛘咿D(zhuǎn)座子上,并以基因盒的形式存在于整合子中。整合子屬于可移動(dòng)基因元件,可借助整合子的移動(dòng)、基因盒的插入、切除而導(dǎo)致細(xì)菌間耐藥性呈水平傳播,同時(shí),基因盒與整合子隨著基因環(huán)境的改變也將不斷進(jìn)化,產(chǎn)生新的耐藥方式,給臨床抗菌治療帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[3]。

        新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-1(NDM-1, New Delhi metallo-betalactamase)最早于2009年從肺炎克雷伯菌的瑞典患者中分離得到[4],其催化活性需要一個(gè)或兩個(gè)鋅離子的協(xié)助,屬于Bush分類中B1類MBL[5,6]。通過對(duì)其三維結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn),其骨架具有α/β/β/α折疊特征[7]。除替加環(huán)素和多粘菌素,NDM-1能夠水解幾乎所有抗生素,藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,NDM-1相比其他大部分NDM-1具有更強(qiáng)的水解活性。NDM-1編碼基因主要攜帶在不同質(zhì)粒上,能夠在敏感菌株中自由轉(zhuǎn)移[8]。

        本文先利用生物信息學(xué)的方法,從NDM-1與其它金屬β-內(nèi)酰胺酶同源性較低入手,對(duì)NDM-1序列進(jìn)行分析,為NDM-1的低同源性和廣譜耐藥性由于基因水平轉(zhuǎn)移過程中造成基因特性改變的猜想提供佐證。然后利用計(jì)算機(jī)分子模擬手段,對(duì)NDM-1與替加環(huán)素進(jìn)行對(duì)接,分析替加環(huán)素抑制NDM-1的分子機(jī)制,為NDM-1抑制劑的合理設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。

        2 材料與方法

        2.1 實(shí)驗(yàn)材料

        金屬-β-內(nèi)酰胺酶氨基酸和編碼基因序列信息來自于生物信息數(shù)據(jù)庫NCBI。首先將NDM-1的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)合文獻(xiàn)[9]中MBL的種類和來源,在BLAST打分較高的序列中篩選氨基酸序列進(jìn)行后續(xù)研究。在NCBI數(shù)據(jù)庫中,下載所有待研究MBL的編碼基因序列,用于基因序列分子進(jìn)化樹的構(gòu)件分析。

        NDM-1 [Klebsiella pneumoniae]和YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594] 編碼基因及其上下游1000bp基因信息均來自生物信息數(shù)據(jù)庫NCBI。分別下載Klebsiella pneumoniae strain 601 plasmid pNDM-OM(NCBI編號(hào):NC_019889.1)和Erythrobacter litoralis HTCC2594 chromosome(NCBI編號(hào):NC_007722.1)的基因序列,找到NDM-1和bl2編碼基因的位置,選取其上下游1000bp的基因序列,進(jìn)行GC含量分析。

        用于與藥物分子替加環(huán)素對(duì)接的蛋白Apo-NDM-1的立體結(jié)構(gòu)3S0Z-A來自蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)PDB數(shù)據(jù)庫。替加環(huán)素藥物分子由Sybyl-x軟件繪制得到。

        2.2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.2.1多序列比對(duì)與分子進(jìn)化樹構(gòu)建

        本文構(gòu)建氨基酸和基因序列進(jìn)化樹的方法是序列相似性比較,利用Mega軟件[10]采用NJ鄰接法對(duì)上述所得金屬-β-內(nèi)酰胺酶的氨基酸和基因序列進(jìn)行多序列比對(duì),生成分子進(jìn)化樹文件,并修改注釋信息,生成環(huán)狀系統(tǒng)樹圖像。

        2.2.2GC含量分析

        在R軟件的seqinr程序包[11]中,計(jì)算NDM-1 [Klebsiella pneumoniae]和YP_458405.1 [Erythrobacter litoralis HTCC2594]編碼基因及其上下游1000bp基因的GC含量,滑動(dòng)窗口為100bp,每次向右滑動(dòng)1bp。以編碼基因開始的位置為橫軸0點(diǎn),得到GC含量隨基因位置變化圖。

        2.2.3替加環(huán)素與NDM-1分子對(duì)接

        選用3S0Z-A蛋白的結(jié)構(gòu)文件,使用pymol軟件包,去掉蛋白質(zhì)中的小分子和水,再利用Sybyl-x軟件繪制替加環(huán)素分子。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)以及CASTp網(wǎng)站工具[12]預(yù)測(cè)得到的3S0Z-A的活性位點(diǎn),將替加環(huán)素分子移動(dòng)到3S0Z-A預(yù)測(cè)作用位點(diǎn)。將對(duì)接文件讀入Autodock軟件中,確定小分子構(gòu)象變化的范圍,進(jìn)行vina批處理,生成最優(yōu)結(jié)合方式的文件以及其結(jié)合能。最后用DS軟件讀入對(duì)接好的文件,選定小分子為中性,顯示與其相距5.00?的蛋白的部分,此范圍為可能形成氫鍵的范圍,統(tǒng)計(jì)與替加環(huán)素分子相距5.00?的氨基酸和該位置出現(xiàn)潛在氫鍵的構(gòu)象個(gè)數(shù)。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 氨基酸序列的分子進(jìn)化樹構(gòu)建

        使用Mega軟件對(duì)金屬β-內(nèi)酰胺酶族的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì),構(gòu)建分子進(jìn)化樹并查看環(huán)狀無根樹結(jié)構(gòu)圖像。分子進(jìn)化樹共分為3個(gè)主枝,分別對(duì)應(yīng)為Bush分類中的三大類。與NDM系列分子進(jìn)化關(guān)系最近的MBL為3個(gè)分類并不明確的bl2,分別為YP_003061440.1[Hirschia baltica ATCC 49814],YP_003270512.1[Haliangium ochraceum DSM 14365],YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594],Hirschia baltica屬于紅細(xì)菌屬,Erythrobacter litoralis屬于赤桿菌屬,Haliangium ochraceum是來源于海洋的一類粘細(xì)菌,三種細(xì)菌均來自于海洋。

        蛋白質(zhì)的序列差異關(guān)系所構(gòu)建的分子進(jìn)化樹,給出分支層次或拓?fù)鋱D形,是產(chǎn)生新的基因復(fù)制或享有共同祖先的生物體的歧異點(diǎn)的一種反映,通過蛋白質(zhì)的分子進(jìn)化樹分析,為從分子水平研究蛋白質(zhì)進(jìn)化關(guān)系。金屬-β-內(nèi)酰胺酶族的氨基酸序列的分子進(jìn)化樹顯示NDM-1與來自海洋細(xì)菌的MBL具有在功能上具有較近的距離。因此,從分子進(jìn)化的角度來看,NDM-1與YP_003061440.1, YP_003270512.1, YP_458405.1具有較高的同源性,而與其他MBL同源性較低。這個(gè)現(xiàn)象啟示我們NDM-1可能在遺傳上與來自海洋細(xì)菌的MBL有著密不可分的關(guān)系。

        3.2 基因序列的分子進(jìn)化樹構(gòu)建

        使用Mega軟件對(duì)金屬-β-內(nèi)酰胺酶族的基因序列進(jìn)行多序列比對(duì),構(gòu)建分子進(jìn)化樹并查看無根樹結(jié)構(gòu)圖像,發(fā)現(xiàn)MBL的基因序列分子進(jìn)化樹與氨基酸序列的分子進(jìn)化樹并不完全一致,改變最為明顯的為NDM系列與三種分類不明確的bl2。與NDM系列分子進(jìn)化關(guān)系最近的MBL基因,其編碼蛋白是YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594],另兩個(gè)與NDM系列功能進(jìn)化關(guān)系較近的M B L,即YP_003061440.1[Hirschia baltica ATCC 49814],YP_003270512.1[Haliangium ochraceum DSM 14365],其基因序列的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

        在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間某個(gè)特定基因序列有較高相似性,一般可以作為基因水平轉(zhuǎn)移的初始證據(jù)或懷疑對(duì)象。雖然進(jìn)化樹也有其本身的缺陷,用于構(gòu)建進(jìn)化樹的序列信息并不能準(zhǔn)確的反映所有物種之間的進(jìn)化關(guān)系,但進(jìn)化樹法仍是檢測(cè)基因水平轉(zhuǎn)移行之有效的方法之一。根據(jù)我們所得到的基因序列分子進(jìn)化樹,與NDM編碼基因分子進(jìn)化關(guān)系最近的MBL編碼基因?yàn)閅P_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]編碼基因,來源物種為海洋細(xì)菌,在物種進(jìn)化關(guān)系上與肺炎克雷伯菌和大腸桿菌等細(xì)菌關(guān)系較遠(yuǎn),這一結(jié)果為NDM-1與基因水平轉(zhuǎn)移相關(guān)提供佐證。

        3.3 GC含量分析

        計(jì)算目標(biāo)基因序列及其上下游1000bp序列的GC含量,取編碼基因起始的地方為x軸的0值,發(fā)現(xiàn)NDM-1上游100~350bp的GC含量異常,出現(xiàn)較大波動(dòng),由60%左右下滑至越35%。與YP_458405.1對(duì)比來看,NDM-1與其在編碼區(qū)段GC含量具有較高的吻合度,平均在63%附近,并且波動(dòng)正常,而在非編碼區(qū)段的上下游1000bp內(nèi)GC含量差別較大,并且沒有直觀的聯(lián)系。

        原核生物不同細(xì)菌物種之間基因的GC含量不同,而每個(gè)細(xì)菌物種基因組GC含量相對(duì)來說是較穩(wěn)定的,不受外界因素影響,某段特定DNA序列的GC含量明顯高于或低于其基因組的其他部分或者出現(xiàn)較為異常的波動(dòng)可以作為推斷其是否發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移的依據(jù)。NDM-1上游GC含量的劇烈波動(dòng)以及其與YP_458405.1編碼基因區(qū)段GC含量的高度吻合,在一定程度上證明了基因水平轉(zhuǎn)移的可能性。

        圖1金屬-β-內(nèi)酰胺酶氨基酸序列的分子進(jìn)化樹Fig.1Phylogenetic tree of metallo-β-lactamase amino acid sequence

        圖2金屬β-內(nèi)酰胺酶基因序列的分子進(jìn)化樹Fig.2Phylogenetic tree of metallo-β-lactamase gene sequence

        圖3NDM-1與YP_458405.1編碼基因的GC含量Fig.3GC content of NDM-1 and YP_458405.1 encoding gene

        3.4 NDM-1與替加環(huán)素對(duì)接分析

        利用Autodock軟件得到9種最優(yōu)的結(jié)合方式(表1),其中最優(yōu)構(gòu)象如圖4所示。在Discovery studio軟件中顯示與替加環(huán)素分子相距5.00?的蛋白部分,記錄對(duì)應(yīng)的氨基酸和該位置出現(xiàn)潛在氫鍵的構(gòu)象個(gè)數(shù)(表2)。

        表1替加環(huán)素與3S0Z-A對(duì)接的最優(yōu)結(jié)合方式Table 1the optimal combination ways of tigecycline docking with 3S0Z-A

        表2與替加環(huán)素分子相距5.00?的氨基酸和該位置出現(xiàn)潛在氫鍵的構(gòu)象個(gè)數(shù)Table 2The amino acid and number of potential hydrogen bonds within 5.00? apart

        NDM-1對(duì)除了多粘菌素(colistin)和替加環(huán)素(圖5)(tigecyline)外的幾乎所有類型的抗生素均具有耐藥性[13]。多粘菌素的反應(yīng)機(jī)理是與原核生物的核糖體S30小亞基相互結(jié)合抑制細(xì)菌,而且現(xiàn)已出現(xiàn)抗藥型菌株。替加環(huán)素是2005年FDA認(rèn)證的抗生素藥物[14],可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制NDM-1蛋白,然而替加環(huán)素并不能始終如一的抑制NDM-1蛋白,所以基于替加環(huán)素的新藥研發(fā)成為一個(gè)治療超級(jí)細(xì)菌感染的突破點(diǎn)。

        圖4替加環(huán)素與3S0Z-A對(duì)接的最優(yōu)構(gòu)象Fig 4the optimal conformation of tigecycline docking with 3S0Z-A

        文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)了Ceftriaxone、Cefepime、Cefoperazone、Imepenum和Meropenum這5種抗生素與3S0Z-A對(duì)接形成的氫鍵方式(表3)[15],結(jié)合本文潛在氫鍵分析統(tǒng)計(jì)(表2),其中204H和165K是其它抗生素的氫鍵區(qū),而替加環(huán)素的9種結(jié)合方式都普遍與氫鍵143H和76H形成氫鍵,即這兩個(gè)氫鍵很可能是替加環(huán)素獨(dú)特的結(jié)合方式。

        表35種抗生素與3S0Z-A對(duì)接形成的氫鍵方式Table 3 hydrogen bond of 5 antibiotics docking with 3S0Z-A

        分析對(duì)接的結(jié)合能改變,最優(yōu)結(jié)構(gòu)為結(jié)合能為-8.8kcal/mol,最差結(jié)構(gòu)為-7.5kcal/mol,均比5種抗生素的結(jié)合能低,所以推斷出替加環(huán)素的IC50可能更小,說明滅菌一半時(shí)所需抗生素藥物濃度更少,所以在同樣濃度抗生素與蛋白質(zhì)作用時(shí)替加環(huán)素比其它β-內(nèi)酰胺類抗生素更加有競(jìng)爭(zhēng)性抑制優(yōu)勢(shì)。

        結(jié)合NDM-1和替加環(huán)素結(jié)合的三維結(jié)構(gòu),ASL1環(huán)位于反應(yīng)中心上,像一個(gè)蓋子一樣蓋住反應(yīng)中心。當(dāng)有底物結(jié)合時(shí)ASL1環(huán)上的76H可能與替加環(huán)素上的-HN-CH2-CO-NH-的2個(gè)N原子形成氫鍵。另外143H可能與替加環(huán)素八氫并四苯環(huán)上的-NH3基團(tuán)形成氫鍵。此外替加環(huán)素上的羰基、氨基等都是可能形成氫鍵的基團(tuán)。這些基團(tuán)都可能通過改變?nèi)〈姆绞絹斫档徒Y(jié)合能,使得更加有競(jìng)爭(zhēng)性優(yōu)勢(shì)。

        圖5替加環(huán)素分子結(jié)構(gòu)Fig 5Molecular structure of tigecycline

        4 結(jié)論

        本文通過對(duì)金屬-β-內(nèi)酰胺酶氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)NDM-1與YP_003061440.1[Hirschia baltica ATCC 49814],YP_003270512.1[Haliangium ochraceum DSM 14365],YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]三種來自海洋細(xì)菌的MBL在功能上關(guān)系較近。而通過對(duì)MBL的基因序列進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)NDM-1僅與YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]具有較近的進(jìn)化關(guān)系。無論從氨基酸序列還是從基因序列,NDM-1與其它MBL進(jìn)化距離均較遠(yuǎn)。分子進(jìn)化樹與物種進(jìn)化樹之間巨大的差異有很大可能是由于基因水平轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的。

        接著,通過對(duì)NDM-1的GC含量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其編碼基因上游100~350bp處具有較大的波動(dòng),而YP_458405.1編碼基因波動(dòng)平緩,NDM-1與YP_458405.1在編碼基因區(qū)段GC含量相似度較高,基于我們對(duì)基因GC含量異??赡艿脑蛘J(rèn)識(shí),認(rèn)為有可能是基因進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致的GC含量異常。

        最后,通過半柔性分子對(duì)接,并對(duì)NDM-1與替加環(huán)素的優(yōu)勢(shì)結(jié)合構(gòu)象的潛在氫鍵進(jìn)行分析,與另外5種抗生素與NDM-1的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行比較,初步確定替加環(huán)素對(duì)于NDM-1蛋白存在競(jìng)爭(zhēng)抑制優(yōu)勢(shì)。

        因此,本文通過NDM-1的功能進(jìn)化關(guān)系和遺傳進(jìn)化關(guān)系,以及NDM-1的GC含量變化,提出NDM-1可能與YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]進(jìn)行基因水平轉(zhuǎn)移相關(guān)的猜想。通過替加環(huán)素與NDM-1分子對(duì)接及與其他藥物分子對(duì)比,提出替加環(huán)素對(duì)于NDM-1蛋白存在競(jìng)爭(zhēng)抑制優(yōu)勢(shì),從而為NDM-1抑制劑的設(shè)計(jì)提供有價(jià)值的信息。

        [1] Walsh T. The emergence and implications of metallo-β-lactamases in Gram-negative bacteria. Clinical Microbiology and Infection,2005, 11(s6): 2-9.

        [2] Ambler R. The Structure of $ beta $-Lactamases. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences,1980, 289(1036): 321-331.

        [3] 李志江, 李海權(quán), 刁現(xiàn)民. 基因水平轉(zhuǎn)移的評(píng)判方法和轉(zhuǎn)移方式研究進(jìn)展. 遺傳, 2008, 30(9): 1108-1114.

        [4] Yong D, Toleman M A, Giske C G,et al.Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene, bla(NDM-1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(12): 5046-5054.

        [5] Zhang H, Hao Q. Crystal structure of NDM-1 reveals a common beta-lactam hydrolysis mechanism. FASEB J, 2011, 25(8): 2574-2582.

        [6] Branko J, Zorica L, Vesna S. Emergence of NDM-1 metallo-betalactamase in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Serbia.Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(8): 3929-3931.

        [7] Green V L, Verma A, Owens R J. Structure of New Delhi metalloβ-lactamase 1 (NDM-1). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2011, 67(Pt 10): 1160-1164.

        [8] Wachino J, Arakawa Y. Exogenously acquired 16S rRNA methyltransferases found in aminoglycoside-resistant pathogenic Gram-negative bacteria: an update. Drug Resist Updat, 2012, 15(3):133-148.

        [9] Bebrone C. Metallo-beta-lactamases (classification, activity, genetic organization, structure, zinc coordination) and their superfamily.Biochem Pharmacol, 2007, 74(12): 1686-1701.

        [10] Tamura K, Dudley J, Nei M. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular biology and evolution, 2007, 24(8): 1596-1599.

        [11] Charif D. Lobry J R. SeqinR 1.0-2: a contributed package to the R project for statistical computing devoted to biological sequences retrieval and analysis. Structural approaches to sequence evolution Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering. Springer,2007: 207-232.

        [12] Dundas J, Ouyang Z, Tseng J ,et al.CASTp: computed atlas of surface topography of proteins with structural and topographical mapping of functionally annotated residues. Nucleic acids research,2006, 34(suppl 2): 116-118.

        [13] Kumarasamy K K, Toleman M A, Walsh T R,et al.Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK:a molecular, biological, and epidemiological study. Lancet Infect Dis, 2010, 10(9): 597-602.

        [14] Livermore D M. Tigecycline: what is it, and where should it be used?Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005, 56(4): 611-614.

        [15] Sowmiya M, Umashankar V, Muthukumaran S,et al.Studies on New Delhi Metallo-Beta-Lactamse-1 producing Acinetobacter baumannii isolated from donor swab in a tertiary eye care centre,India and structural analysis of its antibiotic binding interactions.Bioinformation, 2012, 8(10): 445-452.

        猜你喜歡
        進(jìn)化樹內(nèi)酰胺酶環(huán)素
        產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌研究現(xiàn)狀
        基于心理旋轉(zhuǎn)的小學(xué)生物進(jìn)化樹教學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告
        多西環(huán)素漲至800元/kg,95%的原料暴漲,動(dòng)保企業(yè)也快扛不住了!
        常見的進(jìn)化樹錯(cuò)誤概念及其辨析*
        艾草白粉病的病原菌鑒定
        β-內(nèi)酰胺酶抑制劑合劑的最新研究進(jìn)展
        過表達(dá)親環(huán)素J 促進(jìn)肝癌的發(fā)生
        產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的臨床分布及耐藥性分析
        親環(huán)素A與慢性心力衰竭相關(guān)性的研究
        層次聚類在進(jìn)化樹構(gòu)建中的應(yīng)用
        成人午夜福利视频镇东影视| 欧美午夜精品久久久久久浪潮| 亚洲啪啪综合av一区| 国产精品青草视频免费播放| 丝袜 亚洲 另类 欧美| 一区二区三区中文字幕有码| 蜜桃在线视频一区二区| 人妻诱惑中文字幕在线视频| 亚洲精品成人片在线观看精品字幕| 毛片无码国产| 久久久国产精品黄毛片| 国产天美传媒性色av| 国产 中文 制服丝袜 另类| 日本女优在线观看一区二区三区| 丝袜美腿诱惑区在线播放| 国产亚洲欧美精品永久| 成人午夜福利视频镇东影视| 日韩精品无码区免费专区| 亚洲av噜噜狠狠蜜桃| 国产av无毛无遮挡网站| 97中文字幕精品一区二区三区| 777精品出轨人妻国产| 欧美天欧美天堂aⅴ在线| 亚洲欧洲一区二区三区波多野| 最全精品自拍视频在线| 午夜秒播久久精品麻豆| 18禁真人抽搐一进一出在线| 小12箩利洗澡无码视频网站| 蜜臀av人妻一区二区三区| 亚洲激情综合中文字幕| 日韩国产精品无码一区二区三区 | 成人影院在线视频免费观看| 人妻丰满熟妇av无码区不卡| 亚洲18色成人网站www| 亚洲 暴爽 AV人人爽日日碰| 蜜桃视频成年人在线观看| 色呦呦九九七七国产精品| 女人被男人爽到呻吟的视频| 中国少妇内射xxxx狠干| 粉嫩少妇内射浓精videos| 亚洲一区二区三区乱码在线|