程琪，溫權(quán)，胡小林，徐真昊，廖智宇，趙一雷，

（1. 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，200240；2. 上海中學(xué)，上海，200231）

近年來，β-內(nèi)酰胺類抗生素（beta-lactam antibiotics）在臨床及農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用，是細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)的原因之一，其中產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶（beta-lactamase）水解該類抗生素是細(xì)菌耐藥的重要機(jī)制之一[1]。根據(jù)Ambler分類法，β-內(nèi)酰胺酶分為A/B/C/D四類，其中，A/C/D三類通過活性位點(diǎn)的絲氨酸殘基來催化水解；而B類β-內(nèi)酰胺酶為金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL, metallo-beta-lactamase)，其活性位點(diǎn)需要一個(gè)或兩個(gè)金屬離子協(xié)助催化水解[2]。MBL可以催化水解除單環(huán)外的所有β-內(nèi)酰胺酶，且對(duì)常規(guī)的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑有抵制作用。金屬酶編碼的耐藥基因位于細(xì)菌染色體、質(zhì)?；蛘咿D(zhuǎn)座子上，并以基因盒的形式存在于整合子中。整合子屬于可移動(dòng)基因元件，可借助整合子的移動(dòng)、基因盒的插入、切除而導(dǎo)致細(xì)菌間耐藥性呈水平傳播，同時(shí)，基因盒與整合子隨著基因環(huán)境的改變也將不斷進(jìn)化，產(chǎn)生新的耐藥方式，給臨床抗菌治療帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[3]。

新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-1(NDM-1, New Delhi metallo-betalactamase)最早于2009年從肺炎克雷伯菌的瑞典患者中分離得到[4]，其催化活性需要一個(gè)或兩個(gè)鋅離子的協(xié)助，屬于Bush分類中B1類MBL[5,6]。通過對(duì)其三維結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，其骨架具有α/β/β/α折疊特征[7]。除替加環(huán)素和多粘菌素，NDM-1能夠水解幾乎所有抗生素，藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，NDM-1相比其他大部分NDM-1具有更強(qiáng)的水解活性。NDM-1編碼基因主要攜帶在不同質(zhì)粒上，能夠在敏感菌株中自由轉(zhuǎn)移[8]。

本文先利用生物信息學(xué)的方法，從NDM-1與其它金屬β-內(nèi)酰胺酶同源性較低入手，對(duì)NDM-1序列進(jìn)行分析，為NDM-1的低同源性和廣譜耐藥性由于基因水平轉(zhuǎn)移過程中造成基因特性改變的猜想提供佐證。然后利用計(jì)算機(jī)分子模擬手段，對(duì)NDM-1與替加環(huán)素進(jìn)行對(duì)接，分析替加環(huán)素抑制NDM-1的分子機(jī)制，為NDM-1抑制劑的合理設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

金屬-β-內(nèi)酰胺酶氨基酸和編碼基因序列信息來自于生物信息數(shù)據(jù)庫NCBI。首先將NDM-1的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)[9]中MBL的種類和來源，在BLAST打分較高的序列中篩選氨基酸序列進(jìn)行后續(xù)研究。在NCBI數(shù)據(jù)庫中，下載所有待研究MBL的編碼基因序列，用于基因序列分子進(jìn)化樹的構(gòu)件分析。

NDM-1 [Klebsiella pneumoniae]和YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594] 編碼基因及其上下游1000bp基因信息均來自生物信息數(shù)據(jù)庫NCBI。分別下載Klebsiella pneumoniae strain 601 plasmid pNDM-OM（NCBI編號(hào)：NC_019889.1）和Erythrobacter litoralis HTCC2594 chromosome（NCBI編號(hào)：NC_007722.1）的基因序列，找到NDM-1和bl2編碼基因的位置，選取其上下游1000bp的基因序列，進(jìn)行GC含量分析。

用于與藥物分子替加環(huán)素對(duì)接的蛋白Apo-NDM-1的立體結(jié)構(gòu)3S0Z-A來自蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)PDB數(shù)據(jù)庫。替加環(huán)素藥物分子由Sybyl-x軟件繪制得到。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1多序列比對(duì)與分子進(jìn)化樹構(gòu)建

本文構(gòu)建氨基酸和基因序列進(jìn)化樹的方法是序列相似性比較，利用Mega軟件[10]采用NJ鄰接法對(duì)上述所得金屬-β-內(nèi)酰胺酶的氨基酸和基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)，生成分子進(jìn)化樹文件，并修改注釋信息，生成環(huán)狀系統(tǒng)樹圖像。

2.2.2GC含量分析

在R軟件的seqinr程序包[11]中，計(jì)算NDM-1 [Klebsiella pneumoniae]和YP_458405.1 [Erythrobacter litoralis HTCC2594]編碼基因及其上下游1000bp基因的GC含量，滑動(dòng)窗口為100bp，每次向右滑動(dòng)1bp。以編碼基因開始的位置為橫軸0點(diǎn)，得到GC含量隨基因位置變化圖。

2.2.3替加環(huán)素與NDM-1分子對(duì)接

選用3S0Z-A蛋白的結(jié)構(gòu)文件，使用pymol軟件包，去掉蛋白質(zhì)中的小分子和水，再利用Sybyl-x軟件繪制替加環(huán)素分子。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)以及CASTp網(wǎng)站工具[12]預(yù)測(cè)得到的3S0Z-A的活性位點(diǎn)，將替加環(huán)素分子移動(dòng)到3S0Z-A預(yù)測(cè)作用位點(diǎn)。將對(duì)接文件讀入Autodock軟件中，確定小分子構(gòu)象變化的范圍，進(jìn)行vina批處理，生成最優(yōu)結(jié)合方式的文件以及其結(jié)合能。最后用DS軟件讀入對(duì)接好的文件，選定小分子為中性，顯示與其相距5.00?的蛋白的部分，此范圍為可能形成氫鍵的范圍，統(tǒng)計(jì)與替加環(huán)素分子相距5.00?的氨基酸和該位置出現(xiàn)潛在氫鍵的構(gòu)象個(gè)數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 氨基酸序列的分子進(jìn)化樹構(gòu)建

使用Mega軟件對(duì)金屬β-內(nèi)酰胺酶族的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建分子進(jìn)化樹并查看環(huán)狀無根樹結(jié)構(gòu)圖像。分子進(jìn)化樹共分為3個(gè)主枝，分別對(duì)應(yīng)為Bush分類中的三大類。與NDM系列分子進(jìn)化關(guān)系最近的MBL為3個(gè)分類并不明確的bl2，分別為YP_003061440.1[Hirschia baltica ATCC 49814]，YP_003270512.1[Haliangium ochraceum DSM 14365]，YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]，Hirschia baltica屬于紅細(xì)菌屬，Erythrobacter litoralis屬于赤桿菌屬，Haliangium ochraceum是來源于海洋的一類粘細(xì)菌，三種細(xì)菌均來自于海洋。

蛋白質(zhì)的序列差異關(guān)系所構(gòu)建的分子進(jìn)化樹，給出分支層次或拓?fù)鋱D形，是產(chǎn)生新的基因復(fù)制或享有共同祖先的生物體的歧異點(diǎn)的一種反映，通過蛋白質(zhì)的分子進(jìn)化樹分析，為從分子水平研究蛋白質(zhì)進(jìn)化關(guān)系。金屬-β-內(nèi)酰胺酶族的氨基酸序列的分子進(jìn)化樹顯示NDM-1與來自海洋細(xì)菌的MBL具有在功能上具有較近的距離。因此，從分子進(jìn)化的角度來看，NDM-1與YP_003061440.1, YP_003270512.1, YP_458405.1具有較高的同源性，而與其他MBL同源性較低。這個(gè)現(xiàn)象啟示我們NDM-1可能在遺傳上與來自海洋細(xì)菌的MBL有著密不可分的關(guān)系。

3.2 基因序列的分子進(jìn)化樹構(gòu)建

使用Mega軟件對(duì)金屬-β-內(nèi)酰胺酶族的基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建分子進(jìn)化樹并查看無根樹結(jié)構(gòu)圖像，發(fā)現(xiàn)MBL的基因序列分子進(jìn)化樹與氨基酸序列的分子進(jìn)化樹并不完全一致，改變最為明顯的為NDM系列與三種分類不明確的bl2。與NDM系列分子進(jìn)化關(guān)系最近的MBL基因，其編碼蛋白是YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]，另兩個(gè)與NDM系列功能進(jìn)化關(guān)系較近的M B L，即YP_003061440.1[Hirschia baltica ATCC 49814]，YP_003270512.1[Haliangium ochraceum DSM 14365]，其基因序列的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間某個(gè)特定基因序列有較高相似性，一般可以作為基因水平轉(zhuǎn)移的初始證據(jù)或懷疑對(duì)象。雖然進(jìn)化樹也有其本身的缺陷，用于構(gòu)建進(jìn)化樹的序列信息并不能準(zhǔn)確的反映所有物種之間的進(jìn)化關(guān)系，但進(jìn)化樹法仍是檢測(cè)基因水平轉(zhuǎn)移行之有效的方法之一。根據(jù)我們所得到的基因序列分子進(jìn)化樹，與NDM編碼基因分子進(jìn)化關(guān)系最近的MBL編碼基因?yàn)閅P_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]編碼基因，來源物種為海洋細(xì)菌，在物種進(jìn)化關(guān)系上與肺炎克雷伯菌和大腸桿菌等細(xì)菌關(guān)系較遠(yuǎn)，這一結(jié)果為NDM-1與基因水平轉(zhuǎn)移相關(guān)提供佐證。

3.3 GC含量分析

計(jì)算目標(biāo)基因序列及其上下游1000bp序列的GC含量，取編碼基因起始的地方為x軸的0值，發(fā)現(xiàn)NDM-1上游100～350bp的GC含量異常，出現(xiàn)較大波動(dòng)，由60%左右下滑至越35%。與YP_458405.1對(duì)比來看，NDM-1與其在編碼區(qū)段GC含量具有較高的吻合度，平均在63%附近，并且波動(dòng)正常，而在非編碼區(qū)段的上下游1000bp內(nèi)GC含量差別較大，并且沒有直觀的聯(lián)系。

原核生物不同細(xì)菌物種之間基因的GC含量不同，而每個(gè)細(xì)菌物種基因組GC含量相對(duì)來說是較穩(wěn)定的，不受外界因素影響，某段特定DNA序列的GC含量明顯高于或低于其基因組的其他部分或者出現(xiàn)較為異常的波動(dòng)可以作為推斷其是否發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移的依據(jù)。NDM-1上游GC含量的劇烈波動(dòng)以及其與YP_458405.1編碼基因區(qū)段GC含量的高度吻合，在一定程度上證明了基因水平轉(zhuǎn)移的可能性。

圖1金屬-β-內(nèi)酰胺酶氨基酸序列的分子進(jìn)化樹Fig.1Phylogenetic tree of metallo-β-lactamase amino acid sequence

圖2金屬β-內(nèi)酰胺酶基因序列的分子進(jìn)化樹Fig.2Phylogenetic tree of metallo-β-lactamase gene sequence

圖3NDM-1與YP_458405.1編碼基因的GC含量Fig.3GC content of NDM-1 and YP_458405.1 encoding gene

3.4 NDM-1與替加環(huán)素對(duì)接分析

利用Autodock軟件得到9種最優(yōu)的結(jié)合方式（表1），其中最優(yōu)構(gòu)象如圖4所示。在Discovery studio軟件中顯示與替加環(huán)素分子相距5.00?的蛋白部分，記錄對(duì)應(yīng)的氨基酸和該位置出現(xiàn)潛在氫鍵的構(gòu)象個(gè)數(shù)（表2）。

表1替加環(huán)素與3S0Z-A對(duì)接的最優(yōu)結(jié)合方式Table 1the optimal combination ways of tigecycline docking with 3S0Z-A

表2與替加環(huán)素分子相距5.00?的氨基酸和該位置出現(xiàn)潛在氫鍵的構(gòu)象個(gè)數(shù)Table 2The amino acid and number of potential hydrogen bonds within 5.00? apart

NDM-1對(duì)除了多粘菌素（colistin）和替加環(huán)素（圖5）（tigecyline）外的幾乎所有類型的抗生素均具有耐藥性[13]。多粘菌素的反應(yīng)機(jī)理是與原核生物的核糖體S30小亞基相互結(jié)合抑制細(xì)菌，而且現(xiàn)已出現(xiàn)抗藥型菌株。替加環(huán)素是2005年FDA認(rèn)證的抗生素藥物[14]，可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制NDM-1蛋白，然而替加環(huán)素并不能始終如一的抑制NDM-1蛋白，所以基于替加環(huán)素的新藥研發(fā)成為一個(gè)治療超級(jí)細(xì)菌感染的突破點(diǎn)。

圖4替加環(huán)素與3S0Z-A對(duì)接的最優(yōu)構(gòu)象Fig 4the optimal conformation of tigecycline docking with 3S0Z-A

文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)了Ceftriaxone、Cefepime、Cefoperazone、Imepenum和Meropenum這5種抗生素與3S0Z-A對(duì)接形成的氫鍵方式（表3）[15]，結(jié)合本文潛在氫鍵分析統(tǒng)計(jì)（表2），其中204H和165K是其它抗生素的氫鍵區(qū)，而替加環(huán)素的9種結(jié)合方式都普遍與氫鍵143H和76H形成氫鍵，即這兩個(gè)氫鍵很可能是替加環(huán)素獨(dú)特的結(jié)合方式。

表35種抗生素與3S0Z-A對(duì)接形成的氫鍵方式Table 3 hydrogen bond of 5 antibiotics docking with 3S0Z-A

分析對(duì)接的結(jié)合能改變，最優(yōu)結(jié)構(gòu)為結(jié)合能為-8.8kcal/mol，最差結(jié)構(gòu)為-7.5kcal/mol，均比5種抗生素的結(jié)合能低，所以推斷出替加環(huán)素的IC50可能更小，說明滅菌一半時(shí)所需抗生素藥物濃度更少，所以在同樣濃度抗生素與蛋白質(zhì)作用時(shí)替加環(huán)素比其它β-內(nèi)酰胺類抗生素更加有競(jìng)爭(zhēng)性抑制優(yōu)勢(shì)。

結(jié)合NDM-1和替加環(huán)素結(jié)合的三維結(jié)構(gòu)，ASL1環(huán)位于反應(yīng)中心上，像一個(gè)蓋子一樣蓋住反應(yīng)中心。當(dāng)有底物結(jié)合時(shí)ASL1環(huán)上的76H可能與替加環(huán)素上的-HN-CH2-CO-NH-的2個(gè)N原子形成氫鍵。另外143H可能與替加環(huán)素八氫并四苯環(huán)上的-NH3基團(tuán)形成氫鍵。此外替加環(huán)素上的羰基、氨基等都是可能形成氫鍵的基團(tuán)。這些基團(tuán)都可能通過改變?nèi)〈姆绞絹斫档徒Y(jié)合能，使得更加有競(jìng)爭(zhēng)性優(yōu)勢(shì)。

圖5替加環(huán)素分子結(jié)構(gòu)Fig 5Molecular structure of tigecycline

4 結(jié)論

本文通過對(duì)金屬-β-內(nèi)酰胺酶氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)NDM-1與YP_003061440.1[Hirschia baltica ATCC 49814]，YP_003270512.1[Haliangium ochraceum DSM 14365]，YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]三種來自海洋細(xì)菌的MBL在功能上關(guān)系較近。而通過對(duì)MBL的基因序列進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)NDM-1僅與YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]具有較近的進(jìn)化關(guān)系。無論從氨基酸序列還是從基因序列，NDM-1與其它MBL進(jìn)化距離均較遠(yuǎn)。分子進(jìn)化樹與物種進(jìn)化樹之間巨大的差異有很大可能是由于基因水平轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的。

接著，通過對(duì)NDM-1的GC含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其編碼基因上游100～350bp處具有較大的波動(dòng)，而YP_458405.1編碼基因波動(dòng)平緩，NDM-1與YP_458405.1在編碼基因區(qū)段GC含量相似度較高，基于我們對(duì)基因GC含量異?？赡艿脑蛘J(rèn)識(shí)，認(rèn)為有可能是基因進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致的GC含量異常。

最后，通過半柔性分子對(duì)接，并對(duì)NDM-1與替加環(huán)素的優(yōu)勢(shì)結(jié)合構(gòu)象的潛在氫鍵進(jìn)行分析，與另外5種抗生素與NDM-1的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行比較，初步確定替加環(huán)素對(duì)于NDM-1蛋白存在競(jìng)爭(zhēng)抑制優(yōu)勢(shì)。

因此，本文通過NDM-1的功能進(jìn)化關(guān)系和遺傳進(jìn)化關(guān)系，以及NDM-1的GC含量變化，提出NDM-1可能與YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]進(jìn)行基因水平轉(zhuǎn)移相關(guān)的猜想。通過替加環(huán)素與NDM-1分子對(duì)接及與其他藥物分子對(duì)比，提出替加環(huán)素對(duì)于NDM-1蛋白存在競(jìng)爭(zhēng)抑制優(yōu)勢(shì)，從而為NDM-1抑制劑的設(shè)計(jì)提供有價(jià)值的信息。

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