楊翩，王邦義，葉健，梁景青，趙興春

（1. 山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原，030001；2. 公安部物證鑒定中心，北京，100038）

人類遺傳標(biāo)記的檢測(cè)和分析是法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別鑒定和親子鑒定的理論基礎(chǔ)。DNA遺傳標(biāo)記由于具有種屬特異性及不隨年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況或環(huán)境變化而改變等特點(diǎn)[1]，逐漸取代血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)成為20世紀(jì)80年代以來(lái)主要的遺傳標(biāo)記技術(shù)。1997年熒光STR檢驗(yàn)方法被推出，隨著激光激發(fā)多色熒光檢測(cè)儀器的普及，STR熒光復(fù)合擴(kuò)增毛細(xì)管電泳自動(dòng)檢測(cè)方法被法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室普遍采用[2]，該方法檢測(cè)快速、靈敏度高，易于標(biāo)準(zhǔn)化和建立數(shù)據(jù)庫(kù)，已成為主流的檢測(cè)技術(shù)。熒光法檢測(cè)中每個(gè)樣本需加入DNA分子量?jī)?nèi)標(biāo)，并與同時(shí)電泳的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行自動(dòng)比對(duì)，方能得出分型結(jié)果。DNA分子量?jī)?nèi)標(biāo)是一系列已知片段大小且連續(xù)排列的熒光標(biāo)記DNA片段，用于建立片段大小與片段到達(dá)檢測(cè)窗時(shí)間的直線回歸方程[3]。本文旨在設(shè)計(jì)并制備出一套國(guó)產(chǎn)化自主化的分子量?jī)?nèi)標(biāo)，以降低實(shí)驗(yàn)及檢案成本。

1 材料與方法

1.1 材料

PCR試劑（2×MasterMix）由公安部物證鑒定中心提供；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；pMD18-T Vector購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1模板的制備pMD18-T Vector連接D12S391的等位基因16割膠回收的DNA片段(Insert），經(jīng)克隆后提取重組質(zhì)粒，用核酸蛋白定量?jī)xNanodrop 1000（ Thermo）測(cè)得質(zhì)粒濃度C（ng/μl）后，在10μl酶切體系（質(zhì)粒1μl、SalⅠ1μl、EcoRⅠ1μl、10×Buffer1μl，ddH2O 6μl）中37℃雙酶切1h，95℃變性10min.根據(jù)質(zhì)粒濃度將10μl酶切產(chǎn)物用TE稀釋至1ng/μl，取1μl 1ng/μl酶切產(chǎn)物補(bǔ)TE至1ml成B液，取1μl B液補(bǔ)TE至1ml成E液，E液即為PCR擴(kuò)增模板。

1.2.2引物的設(shè)計(jì)及測(cè)試用primer5.0軟件分析pMD18-T Vector質(zhì)粒的全序列，在其1963bp處至2284bp處，ATGC含量均一，無(wú)特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)。選取該500bp左右區(qū)域，在上游（5'）設(shè)計(jì)一條固定引物，在下游設(shè)計(jì)合成目的片段的一系列下游引物。將設(shè)計(jì)出的上下游引物兩兩組合，對(duì)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，挑選出能擴(kuò)增出目的片段的上下游引物組合。

1.2.3PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物檢測(cè)10μlPCR擴(kuò)增體系，內(nèi)含2× MasterMix（公安部物證鑒定中心）5μl, 2.5μmol/L上下游引物各2μl，模板1μl. 擴(kuò)增在9700 型基因擴(kuò)增儀（Applied Biosystems公司）上進(jìn)行，熱循環(huán)參數(shù)為: 95℃ 11min; 94℃ 30s，59℃ 2min， 72℃ 1min，29個(gè)循環(huán)；60℃60min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取1μl擴(kuò)增產(chǎn)物加9μl的TE稀釋10倍，再取1μl稀釋后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與20μl去離子甲酰胺和內(nèi)標(biāo)混合物混勻后，95℃ 5min變性，-20℃ 5min，用ABI 3130XL 型遺傳分析儀（Applied Biosystems 公司）進(jìn)行電泳檢測(cè)，ABI 3130XL Data Collection Software 3.1收集數(shù)據(jù)，GeneMapper IDV3.3軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)。

1.2.4DNA分子量?jī)?nèi)標(biāo)的制備取65bp、105bp、149bp、200bp、241bp、269bp、311bp、345bp、400bp、450bp、500bp等11個(gè)片段PCR產(chǎn)物各1μl，混勻后經(jīng)ABI 3100XL遺傳分析儀檢測(cè)，根據(jù)峰高適當(dāng)調(diào)整不同片段加樣量，使各峰峰高達(dá)到均衡。

2 結(jié)果

2.1 引物篩選

圖165bp-500bp11個(gè)片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 PCR amplification results of 11 fragments range from 65bp to 500bp

用上述引物設(shè)計(jì)方法共設(shè)計(jì)出了1條熒光標(biāo)記的上游引物，24條普通下游引物。用上述10μl擴(kuò)增體系對(duì)各對(duì)引物進(jìn)行測(cè)試，最終挑選出11對(duì)合適的引物組合，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳顯示，65bp-500bp的DNA片段均已擴(kuò)增出（圖1），且片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3 DNA分子量?jī)?nèi)標(biāo)結(jié)果

將65bp-500bp的11個(gè)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物混合調(diào)平，調(diào)平加樣量見(jiàn)表2，調(diào)平結(jié)果見(jiàn)圖2，可見(jiàn)出峰位置正確，無(wú)明顯雜峰，可用于毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

3 討論

自從20世紀(jì)80年代DNA分析技術(shù)面世后，DNA測(cè)序儀或遺傳分析儀得到了廣泛應(yīng)用。這類儀器分析DNA分子量時(shí)需要一個(gè)分子量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行計(jì)算，即分子量?jī)?nèi)標(biāo)，又叫分子量?jī)?nèi)對(duì)照（Internal Lane Standard）[4,5]。與傳統(tǒng)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物（Marker）[6～8]相比，分子量?jī)?nèi)標(biāo)屬內(nèi)對(duì)照，其攜帶有熒光標(biāo)記并與待測(cè)樣品在同一毛細(xì)管中檢測(cè)，因此校對(duì)結(jié)果更加準(zhǔn)確。另外，分子量?jī)?nèi)標(biāo)所用的電泳介質(zhì)是

毛細(xì)管電泳膠，分辨率可達(dá)1個(gè)bp，比瓊脂糖凝膠分辨率（幾十個(gè)bp）提高了幾十倍，因此其精確度也更高[9]。

本實(shí)驗(yàn)選用pMD18-T載體為模板，與高陽(yáng)等[10]選用pUC18質(zhì)粒為模板相比，其優(yōu)點(diǎn)在于：1. pMD18-T載體由pUC18載體改建而成，在pUC18載體的多克隆位點(diǎn)處的Xba I和Sal I識(shí)別位點(diǎn)之間插入了EcoR V識(shí)別位點(diǎn)，用EcoR V進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3'端添加“T”而成。這樣的處理使得pMD18-T載體連接Insert以及克隆的效率大大提高，從而能夠得到較多量的模板。2. pMD18-T載體作為模板進(jìn)行PCR之前，首先經(jīng)過(guò)雙酶切變?yōu)榫€狀DNA，一方面縮短了模板長(zhǎng)度，使PCR更有效的進(jìn)行，另一方面將模板DNA由環(huán)狀變?yōu)榫€狀，提高了擴(kuò)增效率、減少了非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生。

本實(shí)驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)快速，效率高，可用于大規(guī)模生產(chǎn)。制備出的DNA分子量?jī)?nèi)標(biāo)可用于實(shí)驗(yàn)、檢案及數(shù)據(jù)庫(kù)建庫(kù)等，具有法醫(yī)物證學(xué)實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表1引物組合Table1 11 primer combinations

表2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物調(diào)平加樣量Table2The content of 11 PCR products in the prepared DNA internal lane standard

圖2制作的DNA分子量?jī)?nèi)標(biāo)Figure 2Prepared DNA internal lane standard

[1] 鄭秀芬. 法醫(yī)DNA分析. 北京: 中國(guó)人民公安大學(xué)出版社, 2002:6-7.

[2] 袁麗.遺傳標(biāo)記分析對(duì)DNA證據(jù)的影響. 證據(jù)科學(xué), 2012, 20(6):737-749.

[3] 侯一平.法醫(yī)物證學(xué). 3版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2009: 128-134.

[4] Dupuy B M, Olaisen B. A dedicated internal standard in fragment length analysis of hyperpolymorphic short tandem repeats. Forensic Sci Int, 1997, 86(3): 207-227.

[5] John M, Butter E, Buel F C , et al. Forensic DNA typing by capillary electrophoresis using the ABI Prism 310 and 3100 genetic analyzers for STR analysis. Electrophoresis, 2004, 25(10-11): 1397-1412.

[6] 劉慧娟, 馮志國(guó), 何光源, 等. 利用PCR技術(shù)快速制備DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物. 生物技術(shù), 2008, 18(2): 38-39.

[7] 王芳, 張俊河, 昝玉璽, 等. DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物的制備. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(15): 6903,6951.

[8] 張穎, 劉發(fā)珍, 李強(qiáng), 等. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)制備技術(shù): 方法與進(jìn)展.中國(guó)生物工程雜志, 2009, 29(8): 119-123.

[9] Dieter L D, Deforce R E M, Millecamps, et al. Comparison of slab gel electrophoresis and capillary electrophoresis for the detection of the fluorescently labeled polymerase chain reaction products of short tandem repeat fragments. J Chromatogr A, 1998, 806(1): 149-155.

[10] 高陽(yáng), 陳初光, 馬斌, 等. 一種分子量?jī)?nèi)標(biāo)的制備方法及用該方法制備的分子量?jī)?nèi)標(biāo): 中國(guó), 200710064713.4. 2007-10-10.