陳文強(qiáng)

（浙江來(lái)益生物技術(shù)有限公司，浙江 嵊州 312400）

發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)酶的影響

陳文強(qiáng)

（浙江來(lái)益生物技術(shù)有限公司，浙江 嵊州 312400）

產(chǎn)凝乳酶活力及C/P（clotting activities/proteolytic activities）值不僅受菌株本身性質(zhì)的影響，還和發(fā)酵條件有關(guān)。由于液態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵條件可控，在工業(yè)化生產(chǎn)凝乳酶方面有較大優(yōu)勢(shì)。由于絲狀真菌適合在固態(tài)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，本章首先將固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)與液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，選擇優(yōu)勢(shì)較大的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；然后對(duì)液態(tài)培養(yǎng)不同孢子培養(yǎng)基、接種量、發(fā)酵時(shí)間及溫度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

發(fā)酵；條件；產(chǎn)酶

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

1.1.1 菌株：米黑毛霉（Mucor miehei） MmV-4 0。

1.1.2 培養(yǎng)基

①孢子培養(yǎng)基：沙氏固體培養(yǎng)基（%）：葡萄糖4，蛋白胨1，瓊脂2。②種子培養(yǎng)基：同發(fā)酵培養(yǎng)基。③豆餅粉培養(yǎng)基：蔗糖5 g/L，豆餅粉50 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaH2PO4·2H2O 3 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L以及NaCl 10 g/L。④GC培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，玉米漿15 g/L，MgSO4· 7H2O 1.5 g/L，初始pH 5.5[1]。⑤麩皮玉米漿豆餅粉培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱WCS培養(yǎng)基）：10%麩皮水解液50 mL，100 g麩皮在去離子水中加入至沸騰，不斷攪拌30 min后，兩層紗布過(guò)濾殘?jiān)?，去離子水定容至1 L，制得10%的鼓皮水解液[2]；其余成分為玉米漿40 g/L、豆餅粉20 g/L，Na2HPO4·12H2O 4 g/L、Na2CO31 g/L以及CaCl21 g/L。⑥蔗糖玉米漿液態(tài)培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱SCT培養(yǎng)基）：蔗糖50 g/L、玉米漿40 g/L，胰蛋白胨0.5 g/L，Na2HPO4·12H2O 4 g/L，Na2CO31 g/L以及CaC121 g/L，每250 mL錐形瓶中裝液量為50 mL，自然pH；115 ℃火菌30 min后待涼接種[3]。

1.2 試劑

考馬斯亮藍(lán)、福林酚以及BSA購(gòu)買(mǎi)自Sigma公司；脫脂乳奶粉為新西蘭進(jìn)口奶粉；培養(yǎng)基中蔗糖等及無(wú)機(jī)鹽均為生化純或分析純。

1.3 生物量的測(cè)定方法

將發(fā)酵液8000 rpm冷凍離心15 min，排除上清液[4]，沉淀菌體倒入空的培養(yǎng)皿中稱量扣除空皿的質(zhì)量即為生物量，單位為g/50mL。

1.4 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基初步選擇

初步選擇四種發(fā)酵培養(yǎng)基，SCT培養(yǎng)基、麩皮玉米漿、GC培養(yǎng)基及豆餅粉四種液態(tài)培養(yǎng)基，固體麩皮培養(yǎng)基作為對(duì)照，研究菌株發(fā)酵的粗酶液的凝乳酶活力；固體培養(yǎng)基測(cè)定樣品為培養(yǎng)基的液態(tài)提取液，其余四種液態(tài)培養(yǎng)基為發(fā)酵液的粗酶液；凝乳酶活性的測(cè)定方法與Arima等的一致；還測(cè)定了C/P值及粗酶液pH的大小。初步選擇一種作為后續(xù)優(yōu)化的對(duì)象。培養(yǎng)條件為28 ℃，160 rpm，培養(yǎng)96 h。

1.5 孢子培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)酶的影響

選擇PDA、沙氏培養(yǎng)基和脫脂乳斜面培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28 ℃，每天觀察菌株生長(zhǎng)情況，活化時(shí)間為斜面表明生成一層黑色（或褐色）孢子，便立即拿出進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)[5]，發(fā)酵溫度28 ℃，160 rpm，培養(yǎng)96 h。

培養(yǎng)基的碳氮比會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程[6,7]；對(duì)葡萄糖和蛋白胨的碳氮比分別為1∶4、1∶1、2∶1、4∶1和6∶1，在6種培養(yǎng)基的試管斜面上劃線活化菌株，轉(zhuǎn)接菌株來(lái)自在土豆固體培養(yǎng)斜面上生長(zhǎng)的孢子。28 ℃培養(yǎng)2 d后，分別在發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)3 d，接種量為兩環(huán)孢子，28 ℃，160 rpm，培養(yǎng)96 h；每組二個(gè)平行試驗(yàn)，然后測(cè)定粗酶液的凝乳活性及C/P比值。

1.6 不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

液態(tài)種子培養(yǎng)基的接種量一般不超過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的10%。本試驗(yàn)選取接種量分別為1%、3%、5%、6%、12%，發(fā)酵培養(yǎng)20 h后的種子培養(yǎng)液分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間96 h，轉(zhuǎn)速160 rpm，每個(gè)平行3次，測(cè)定粗酶液的凝乳活性以及C/P的比值。

1.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

米黑毛霉MmV-4在發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，溫度28 ℃，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速160 rpm，接種量2環(huán)孢子；每隔24 h對(duì)發(fā)酵液的凝乳活性、生物量和C/P比值進(jìn)行測(cè)定。

1.8 不同溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

選擇28、30、37 ℃，每組3個(gè)平行，研究溫度對(duì)凝乳酶活性和C/P值的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的初步選擇

表1顯示：豆餅粉液態(tài)培養(yǎng)基粗酶液凝乳酶活性較低，蔗糖胰蛋白胨培養(yǎng)基，固體麩皮培養(yǎng)基和麩皮玉米漿培養(yǎng)基的粗酶液表現(xiàn)較高。蔗糖玉米漿培養(yǎng)基較適合作為生產(chǎn)凝乳酶的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，比麩皮固體培養(yǎng)基產(chǎn)凝乳酶活力高2倍。最后，確定蔗糖玉米漿培養(yǎng)基為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵培養(yǎng)基。

表1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)凝乳酶活力、蛋白酶活力及pH的影響

2.2 孢子培養(yǎng)基種類對(duì)產(chǎn)酶的影響

表2顯示：不同活化培養(yǎng)基培養(yǎng)MmV-4菌株，產(chǎn)凝乳酶活力及C/P值差異較大，其中用沙氏培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中得到結(jié)果最好。

表2 不同活化發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)凝乳酶活力、C/P的影響

圖1顯示：活化培養(yǎng)基的碳氮比為4∶1時(shí)發(fā)酵得到的粗酶液凝乳酶活性最高，碳氮比為1∶4時(shí)，發(fā)酵得到的粗酶液凝乳酶活性大幅降低。枯草芽袍桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)現(xiàn)，用牛肉膏（3 g/L）和蛋白胨（5 g/L）作活化培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基中添加為豆餅粉（50 g/L），蛋白胨（5 g/L）以及蔗糖（2 g/L），經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化最終獲得凝乳酶活力大小為600 SU/mL，蛋白酶活力為0.28。說(shuō)明發(fā)酵前種子培養(yǎng)基中添加適宜碳氮源種類及比例，對(duì)提高發(fā)酵過(guò)程凝乳酶活力和C/P值作用顯著。

圖1 沙氏培養(yǎng)基碳氮比對(duì)凝乳酶活力和C/P值的影響

2.3 不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖2顯示：當(dāng)種子培養(yǎng)基的接種量＞5%時(shí)，會(huì)明顯抑制發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶活力和C/P值的大小。接種量為3%時(shí)的C/P比值較1%高，所以選擇3%為最適接種量。

圖3 溫度對(duì)凝乳酶活力及C/P值的影響

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

不同研究者報(bào)道不同菌株發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的最適發(fā)酵時(shí)間為1～8 d，米黑毛霉和毛酶J20為4 d，微小毛霉為3 d，橘青霉為8 d，納豆枯草芽袍桿菌為1 d。

MmV-4菌株合成凝乳酶發(fā)酵顯示：到發(fā)酵48 h后，凝乳酶活力逐漸增長(zhǎng)，到84 h發(fā)酵液中凝乳酶活力達(dá)到最大值為270 SU/mL，同時(shí)C/P的比值也最高為60；隨后，凝乳酶活力和C/P值出現(xiàn)下降趨勢(shì)?？梢钥闯?，MmV-4菌株合成凝乳酶為滯后合成模式。分析原因，可能凝乳酶生成受抑制物的影響而滯后合成，通過(guò)去除抑制物可能延長(zhǎng)發(fā)酵過(guò)程凝乳酶合成時(shí)間。

2.5 不同溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖3顯示：28 ℃為最適培養(yǎng)溫度。

圖2 接種量對(duì)凝乳酶活力和C/P值的影響

3 小 結(jié)

固液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)米黑毛霉的對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蔗糖胰蛋白胨較固態(tài)發(fā)酵的凝乳酶活性高2倍。液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中主要是碳氮源的種類和比例對(duì)發(fā)酵液中凝乳活性的影響明顯，豆餅粉作為唯一氮源的液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵米黑毛霉的發(fā)酵液中基本檢測(cè)不到凝乳酶活性；不同培養(yǎng)基凝乳酶活性大小為蔗糖胰蛋白胨＞鼓皮玉米漿培養(yǎng)基＞豆餅粉蔗糖培養(yǎng)基。

不同活化培養(yǎng)基對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶影響較大。當(dāng)菌株在4%葡萄糖和1%蛋白胨的培養(yǎng)基上活化后，發(fā)酵凝乳活性比在PDA培養(yǎng)基上高2倍。

經(jīng)接種量、發(fā)酵時(shí)間及溫度等發(fā)酵條件優(yōu)化，確定最優(yōu)接種量為3%，最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間為84 h，最適溫度為28 ℃；凝乳酶活力為優(yōu)化前的1.5倍，達(dá)到60 SU/mL；C/P值為優(yōu)化前1.32倍，達(dá)到280。

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R-03

B

1671-8194（2014）14-0065-03