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(1 青島大學醫(yī)學院組織胚胎學教研室，山東 青島 266021； 2 北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院)

CUGBP1在人肺腺癌組織和細胞中的表達

張靜1,曹留霞1,于舒飛2,劉曉萍1,陳琛1,卞晶晶1

(1 青島大學醫(yī)學院組織胚胎學教研室，山東 青島 266021； 2 北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院)

目的比較分析CUGBP1基因在人肺腺癌組織和細胞內表達的特點，及其CUGBP1表達水平與癌細胞增殖活性的關系。方法以人肺腺癌組織標本和人肺腺癌細胞株A549為研究對象，應用免疫組化、Western Blot、RT-PCR方法檢測人肺腺癌組織、細胞內CUGBP1蛋白和基因的表達，并分析其特點。結果CUGBP1基因主要在人肺腺癌組織的細胞核呈強陽性表達，在所有類型腺癌組織中80%以上的癌巢細胞CUGBP1基因呈陽性表達，陽性表達率明顯高于正常對照組，差異有顯著性(t′=100.01,P<0.001)。95%以上的A549細胞CUGBP1表達呈陽性，且CUGBP1表達量明顯低于LPS組,差異有顯著性(t=407.53,P<0.001)。結論CUGBP1基因在人肺腺癌癌巢細胞和A549細胞的胞核內高表達；炎性刺激可增強人肺腺癌細胞株A549的增殖和CUGBP1基因表達；CUGBP1基因可能成為人肺腺癌的早期診斷和增殖狀態(tài)判斷的新指標。

肺腫瘤；人肺腺癌細胞株A549；基因，CUGBP1；脂多糖類

已有研究結果表明，大約25%的成人腫瘤是由慢性炎癥而引起[1]。因此，炎癥被稱為“癌癥的第七大特征”[2]。CUGBP1作為CELF 家族的創(chuàng)始成員，其作用主要集中于對RNA的可變剪切、mRNA的翻譯和mRNA的降解調控等，并對機體正常發(fā)育和某些疾病的發(fā)生起著重要的作用[3-5]，但其與肺癌發(fā)生的關系，迄今僅有個別報道[6]。本實驗選擇人肺腺癌組織和A549細胞作為研究對象，從蛋白和核酸水平探究CUGBP1在人肺腺癌組織和細胞中的表達，探討其炎性因子脂多糖(LPS)誘導對人肺腺癌細胞增殖和CUGBP1表達的關系。以期尋找早期診斷人肺腺癌和有效反映人肺腺癌組織細胞增殖和遷移活性的指標?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1材料來源

我院附屬醫(yī)院病理科人肺腺癌組織及正常對照癌旁組織標本50例。由病理科3名資深的醫(yī)師聯(lián)合做出病理診斷，確診為肺腺癌，并且具有完整的臨床資料，正常對照癌旁組織為距離癌病灶3～5 cm處的組織。人肺腺癌細胞系A549由我院附屬醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2主要試劑

LPS購自美國Sigma公司。改良型RPMI 1640培養(yǎng)液及胎牛血清為Hyclone公司產品；兔抗人CUGBP1多克隆抗體購自英國Abcom公司；PV-9000二抗試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京博奧森有限公司；RT-PCR Trizol試劑、cDNA合成試劑盒和premix ex taq均購自TaKaRa公司。

1.3引物

引物由上海生工生物工程有限公司合成，其中用于RT-PCR的目的基因CUGBP1引物序列：上游引物5′-ACCAGAATCTTCTGACACAGCA-3′，下游引物5′-CAAAACCAAAACACTTGCTCAG-3′。以GAPDH為內參照，GAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.4肺癌標本的收集

將新鮮標本一部分用甲醛固定、石蠟包埋，進行免疫組化染色。另一部分放入DEPC處理過的Eppendorf管中至液氮片刻，隨后放入-80 ℃冰箱保存,備用于總RNA和總蛋白提取。

1.5人肺癌及癌旁組織CUGBP1蛋白的檢測

1.5.1免疫組化檢測 按PV-9000說明書進行免疫組化染色(一抗為1∶100的CUGBP1，PBS代替一抗作為陰性對照)，DAB顯色，蘇木精復染。計數(shù)CUGBP1蛋白陽性表達率。

1.5.2蛋白質印跡法檢測 裂解組織，提取總蛋白，紫外線分光光度法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離總蛋白，分離膠濃度為125 g/L；然后電轉移至PVDF膜上，然后按試劑盒說明書進行操作，一抗CUGBP1(1∶10 000)、GAPDH(1∶2 000),HRP-二抗(1∶1 000稀釋),顯影。實驗重復3次，拍照并記錄。

1.6人肺癌及癌旁組織CUGBP1 mRNA 檢測

以Trizol提取組織總RNA，紫外線分析測定所提 RNA濃度。根據(jù)TaKaRa公司的逆轉錄說明書操作逆轉錄反應生成cDNA。然后進行PCR擴增反應。PCR反應體系共20 μL，其中premix ex taq 10 μL、10 μmoL/L上游引物0.8 μL、10 μmoL/L下游引物0.8 μL、cDNA 2.0 μL、水 6.4 μL。各組以95 ℃變性5 min，按下列條件擴增：CUGBP1：98 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35個循環(huán)。GAPDH：98 ℃、10 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s；然后72 ℃延伸10 min。產物于20 g/L的瓊脂糖凝膠中以120 V電壓電泳，紫外線下觀察，凝膠成像儀照相，Quantity One軟件分析條帶吸光度(A)值。

1.7LPS刺激的人肺腺癌A549細胞的活性測定

取處于對數(shù)生長期A549細胞,以含體積分數(shù)0.10胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調細胞密度為5×106/L后，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180 μL，常規(guī)培養(yǎng)12 h，隨機分為對照組和LPS組，LPS組加LPS終濃度為25 mg/L，對照組加等量營養(yǎng)液。每組設5個復孔，培養(yǎng)24 h。于終止實驗前4 h每孔加5 g/L MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸棄150 μL上清液，每孔加入150 μL DMSO,輕輕振蕩10 min，酶標儀測定波長490 nm處各孔A值。

1.8LPS刺激的人肺腺癌A549細胞中CUGBP1蛋白的表達

1.8.1免疫細胞化學檢測 將處于對數(shù)生長期的A549細胞接種于6孔板中培養(yǎng)(部分孔內預先置有小玻片),待細胞達到80%～85%融合時，隨機分為對照組(等量營養(yǎng)液)和LPS組(終濃度25 mg/L)，24 h后收集小玻片，PBS洗3次，多聚甲醛固定，按1.4步驟進行免疫組化染色，計算CUGBP1陽性表達率和強度，用Image-pro Plus軟件對陽性信號的強度定量分析；另一部分細胞提取總蛋白。

1.8.2蛋白質印跡法檢測 參照1.4的方法。

2 結 果

2.1人肺腺癌和正常對照組織中CUGBP1蛋白和基因的表達

CUGBP1蛋白陽性反應呈黃色或棕褐色顆粒，主要表達于肺腺癌組織的癌巢上皮細胞核中。中分化管狀腺癌間質成分較多，肺腺癌細胞呈高柱狀，沿肺泡腔擴散，形成腺樣結構；低分化腺癌腺泡密集，分化程度低。細支氣管肺泡腺癌，癌細胞沿肺泡壁呈多層生長，肺泡壁增厚，癌細胞呈立方形或矮柱狀；支氣管腺型腺癌腺腔內含有黏液；腺鱗癌癌巢內見低分化鱗狀細胞癌成分及由柱狀上皮組成的腺癌成分。所有腺癌樣本組織均可見CUGBP1蛋白陽性表達，CUGBP1蛋白陽性細胞占癌細胞的80%以上。而不同個體同種類型的腺癌標本CUGBP1蛋白陽性百分率和表達強度均有所差異；癌旁組織可見終末細支氣管上皮的細胞核呈陽性表達,塵細胞CUGBP1蛋白呈陰性表達。肺癌組織CUGBP1蛋白表達陽性率為(80±3)%，對照組為(29±2)%，兩者比較差異有顯著性(t′=100.01,P<0.001)。

CUGBP1電泳帶顯示，肺癌組織CUGBP1基因表達量為42.35±2.14，對照組為19.14±1.15,兩者比較差異有顯著性(t=16.55,P<0.001)。

2.2LPS孵育對A549細胞增殖活性和CUGBP1蛋白表達的影響

MTT檢測結果顯示，LPS孵育可以顯著增強A549細胞的增殖活性((0.69±0.01)A)，與對照組((0.48±0.02)A)相比，差異有顯著意義(t=16.27,P<0.001)。免疫細胞化學染色顯示，A549細胞貼壁生長，95%以上細胞內CUGBP1表達呈陽性，且CUGBP1表達量(849.65±4.15)明顯低于LPS組(2 003.58±2.79),差異有顯著意義(t=407.53,P<0.001)。Western Blot檢測結果也顯示，LPS孵育A549細胞內CUGBP1蛋白表達量(78.25±2.47)較正常對照組(20.52±3.56)明顯增加,差異有顯著性(t=16.95,P<0.001)。肺癌組織CUGBP1蛋白表達量((65.35±2.35)A)較正常對照組((27.36±3.45)A)也明顯增加，差異有顯著性(t=16.95,P<0.001)。

3 討 論

近半個世紀以來，隨著工業(yè)化的發(fā)展，肺癌發(fā)病率和死亡率一直呈明顯上升趨勢。非小細胞肺癌(NSCLC)進展迅速，通常就診時有轉移或已到晚期，對化療不敏感，預后差，早期診斷是決定肺癌治療、延長病人生命的關鍵。目前尚無確切標志物及早期診斷指標。因此，尋找早期診斷NSCLC的標志物，探討肺癌標志物與癌細胞增殖的關系，將為肺癌早期診斷和有效治療提供有價值的依據(jù)[7-8]。

CUGBP1作為RNA結合蛋白，參與了多種人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。有研究認為，上調CUGBP1可以降低CD9 基因水平。而CD9表達降低與前列腺癌、乳癌、結腸癌、非小細胞肺癌、口腔鱗癌、急性髓細胞白血病及B型淋巴細胞白血病等多種腫瘤的惡化及全身轉移相關[9-10]。認為CUGBP1 通過調節(jié)CD9，發(fā)揮促進細胞增殖及 DNA 合成、促進細胞周期進程、抑制細胞凋亡，進而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的癌基因樣作用。目前尚不清楚不同類型肺腺癌組織、癌旁組織細胞中CUGBP1表達的形態(tài)學特點和差異性。本實驗結果顯示，CUGBP1在肺腺癌病人的癌旁組織內的終末細支氣管上皮細胞的胞核呈陽性表達，而在癌周和肺泡隔的結締組織細胞、塵細胞中呈陰性表達。體外培養(yǎng)觀察到90%以上的人肺腺癌細胞株A549細胞的胞質和胞核CUGBP1表達呈陽性，其胞核內表達更顯著。

目前，越來越多的證據(jù)表明，炎性反應與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究認為炎癥部位的細胞因子、趨化因子的持續(xù)存在和由其引發(fā)的級聯(lián)反應能夠誘導細胞的增殖,趨化炎癥細胞的聚集,增加活性氧產物的產生,導致DNA氧化損傷。有DNA損傷或發(fā)生了基因突變的增殖細胞在富含炎癥細胞和多種生物因子的微環(huán)境中繼續(xù)失控性增殖,修復程序混亂,最終導致癌變[11]。本實驗結果顯示，炎性啟動因子LPS可促進A549細胞增殖，幾乎所有A549細胞CUGBP1表達均明顯增強。提示CUGBP1基因高表達與炎性刺激、癌細胞增殖有關，進而表明CUGBP1可能作為判斷肺腺癌增殖活性的一個有效指標。本研究探討人肺腺癌細胞中CUGBP1表達與癌細胞增殖的關系，將為其用于肺癌的早期診斷、預防和治療效果的判斷提供實驗依據(jù)。然而，本研究結果顯示，在癌旁組織內的終末細支氣管部分上皮細胞的胞核內CUGBP1也為陽性表達，這些細胞是處于正常、還是在癌變中尚待深入探討。

[1] BALKWILL F, MALLTOVANI A. Inflammation and cancer: back to virchow [J]. Lancet, 2001,357(9255):539-545.

[2] MANTOVANI A, AUAVENA P, SICA A, et al. Cancel-related inflammation [J]. Nature, 2008,454(7203):436-444.

[3] LEE J E, LEE J Y, WILUSZ J, et al. Systematic analysis of cis-elements in unstable mRNAs demonstrates that CUGBP1 is a key regulator of mRNA decay in muscle cells [J]. PLoS One, 2010,5(6):11201.

[4] VLASOVA I A, TAHOE N M, FAN D, et al. Conserved GU-rich elements mediate mRNA decay by binding to CUG-binding protein 1 [J]. Mol Cell, 2008,29(2):263-270.

[5] ZHANG L, LEE J E, WILUSZ J, et al. The RNA-binding protein CUGBP1 regulates stability of tumor necrosis factor mRNA in muscle cells: implications for myotonic dystrophy [J]. Biol Chem, 2008,283(33):22457-22463.

[6] JIAO W, ZHAO J, WANG M, et al. CUG-binding protein 1 (CUGBP1) expression and prognosis of non-small cell lung cancer[J]. Clin Transl Oncol, 2013,15(10):789-795.

[7] 趙淑芳,梁輝. 肺癌病人血清降鈣素水平的檢測及其意義[J]. 齊魯醫(yī)學雜志, 2011,26(4):293-294.

[8] 王冠群,陳樺. 肺癌A549細胞P物質和NK-1表達SR140333對其影響[J]. 齊魯醫(yī)學雜志, 2011,26(3):211-213.

[9] WANG J C, BEGIN LR, BERUBE N G, et al. Down-regulation of CD9 expression during prostate carcinoma progression is associated with CD9 mRNA modifications [J]. Clin Cancer Res, 2007,13(8):2354-2361.

[10] GANDEMER V, RIO AG, DE TAYRAC M, et al. Five distinct biological processes and 14 differentially expressed genes characterize TEL/AML1-positive leukemia[J]. BMC Geno-mics, 2007,8:385.

[11] SCOTT H R, MCMILLAN D C, FORREST L M, et al. The systemic inflammatory response, weight loss, performance status and survival in patients with inoperable non-small cell lung cancer [J]. Br J Cancel, 2002,87(3):264-267.

(本文編輯 厲建強)

EXPRESSIONOFCUGBP1INHUMANLUNGADENOCARCINOMATISSUEANDCELLS

ZHANGJing,CAOLiuxia,YUShufei,LIUXiaoping,CHENChen,BIANJingjing

(Department of Histology and Embryology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

ObjectiveTo compare and analyze the characteristics of CUGBP1 gene expression in human lung adenocarcinoma (LAC) tissue and in its cells, and the relationship between the expression level and the proliferation activity of the cancer cells.MethodsThe specimens of human LAC tissue and LAC A549 served as the object of research. The CUGBP1 protein and mRNA expression in the tissue and cells were detected by immunohistochemistry, Western Blot and RT-PCR method, their cha-racteristics were analyze as well.ResultsUGBP1 genes showed strongly positive expression mainly in nuclei of human LAC tissue. In all types of adenocarcinoma tissues,80% of CUGBP1 gene expression in cancer cell nest were positive, which were obviously higher than the control (t′=100.01,P<0.001), and more than 95% of CUGBP1 expression in A549 were positive, cell CUGBP1 expression of 95% of A549 cells was positive, and the expression level of CUGBP1 was significantly lower than that in LPS group (t=407.53,P<0.001).ConclusionHigh expressions of CUGBP1 genes were noted in human lung adenocarcinoma cells and nuclei of A549 cells. Inflammatory stimulus can enhance the proliferation of A549 and expression of UGBP1. CUGBP1 gene is likely to become a new marker for early diagnosis of lung adenocarcinoma and proliferation status of the disease.

lung neoplasms; human lung neoplasms A549 cells; gene, CUGBP1; lipopolysaccharides

2013-10-16;

2014-04-11

山東省自然科學基金資助課題(ZR2012CM008)

張靜(1987-)，女，碩士研究生。

劉曉萍(1957-)，女，教授，碩士生導師。E-mail:xplyu2008@126.com。

R734.2

A

1008-0341(2014)03-0207-03