林希 周毅 徐苗苗 林祥 邵深深 朱雪瓊 郎瑋

中藥紅曲對高脂血癥大鼠PPARγ和脂聯(lián)素受體表達(dá)的影響

林希 周毅 徐苗苗 林祥 邵深深 朱雪瓊 郎瑋

目的 探討中藥紅曲對高脂血癥大鼠主動脈過氧化物酶體增殖物活化受體γ（PPARγ）和脂聯(lián)素受體1和2（AdipoR1/AdipoR2）mRNA的影響。方法 SPF級雄性SD大鼠36只,隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組（12只）和高脂組（24只），高脂飼料喂養(yǎng)12周后高脂組造模成功，隨機(jī)分為模型組和紅曲組，每組12只，分別予0．9%氯化鈉溶液和紅曲水提液灌胃4周，檢測血脂水平，HE染色觀察主動脈病理改變，Western boltting檢測PPARγ表達(dá)，ELISA檢測血清脂聯(lián)素水平,實(shí)時熒光定量PCR檢測AdipoR1/AdipoR2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 高脂組TG、TC和LDL-C升高，HDL-C下降（P＜0．05）；給藥4周后，與模型組比較，紅曲組TG、TC和LDL-C降低（P＜0．01或0．05），HDL-C升高（P＜0．05）；紅曲組血清脂聯(lián)素、AdipoR1和AdipoR2 mRNA的表達(dá)較模型組升高（P＜0．05或0．01）。結(jié)論 紅曲能降低高脂血癥大鼠血脂水平，其機(jī)制可能與增加主動脈PPARγ蛋白的表達(dá)，升高血清脂聯(lián)素水平及AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達(dá)有關(guān)。

高脂血癥 主動脈 紅曲 過氧化物酶體增殖物活化受體γ 脂聯(lián)素 脂聯(lián)素受體

高脂血癥的一個重要特點(diǎn)是脂蛋白在血管內(nèi)皮沉積所引起的動脈粥樣硬化。氧化修飾的脂蛋白可以使巨噬細(xì)胞聚集，反過來巨噬細(xì)胞又可以攝取氧化修飾的脂蛋白而成為泡沫細(xì)胞，逐漸形成動脈粥樣硬化[1]。動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展與高血壓、冠心病、腦卒中等心腦血管疾病密切相關(guān)。PPARγ是一類受配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，它是核受體超家族的成員，可以調(diào)節(jié)某些特定的基因轉(zhuǎn)錄，同時具有調(diào)節(jié)血脂，控制血管炎癥，增強(qiáng)胰島素敏感性等作用。脂聯(lián)素是近年來新發(fā)現(xiàn)的由白色脂肪組織分泌的一種激素，參與糖脂代謝，具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、改善胰島素抵抗等生物學(xué)效應(yīng)[2]。脂聯(lián)素受體分為兩個亞型，即AdipoR1和AdipoR2。有研究證實(shí)AdipoR受到PPARγ的調(diào)控，PPARγ的激活可以促使脂聯(lián)素的表達(dá)和釋放[3]。紅曲，古稱“丹曲”，是由紅曲霉屬真菌接種于大米上經(jīng)過發(fā)酵制備而成。據(jù)《本草綱目》記載，紅曲具有消食活血、健脾養(yǎng)胃等功能?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)紅曲也具有降血脂作用[4]，這可能與紅曲中具有的天然他汀類物質(zhì)Monacolin K（莫納可林K，又稱酸式洛伐他?。┟芮邢嚓P(guān)。故本研究擬在建立高脂血癥大鼠動物模型的基礎(chǔ)上，探討紅曲對血脂、PPARγ和脂聯(lián)素及相關(guān)受體的影響，為其治療高脂血癥及相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、試劑和儀器 SPF級雄性SD大鼠36只，體重180～220g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號為SYXK（浙）2013-0032。紅曲水提液由溫州醫(yī)科大學(xué)溫州市第三臨床學(xué)院中藥房提供,含生藥0.625g/ml；PPARγ兔抗大鼠一抗，β-actin兔抗小鼠一抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（美國Santa Cruz公司）；脂聯(lián)素ELISA試劑盒（上海朗卡生物有限公司）；7600-110全自動生化分析儀（日本HITACHI公司）；蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；全波長掃描多功能酶標(biāo)儀（美國BIO-TEK公司）；Trizol抽提試劑（美國Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大Fermentas公司）；SYBR Green染料、LightCycler 480 PCR儀（德國Roche公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組（12只）和高脂組（24只），正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，由溫州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。高脂組大鼠給予高脂飼料（7.5%豬油、2%膽固醇、5%蛋黃粉、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.3%去氧膽酸鈉、85%基礎(chǔ)飼料），喂養(yǎng)12周后，禁食過夜，眼球后靜脈取血3ml,室溫下靜置1h，3 000r/min離心5min，測血脂4項(xiàng)。隨后將高脂組再隨機(jī)分為兩組（每組各12只）：模型組在給予高脂飼料的基礎(chǔ)上每天以0.9%氯化鈉溶液10ml/ kg灌胃；紅曲組在飼以高脂飼料基礎(chǔ)上每天以紅曲水提液10ml/kg灌胃，持續(xù)4周。給藥劑量根據(jù)大鼠體重變化適時調(diào)整。4周末，大鼠禁食過夜，以6%水合氯醛腹腔麻醉后，左心室穿刺取血3ml，3 000r/min離心5min，分離血清進(jìn)行血清指標(biāo)測定；分離處于麻醉狀態(tài)的大鼠胸主動脈，用于HE染色及其他指標(biāo)測定。

1.2.2 血清標(biāo)本測定 使用全自動生化分析儀測定TG、TC、LDL-C和HDL-C水平；根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測血清脂聯(lián)素含量。

1.2.3 HE染色 取主動脈中段（約0.5cm），4%多聚甲醛固定過夜，進(jìn)行石蠟包埋,連續(xù)切片,切片厚度為0.5μm，切片脫蠟、水化，HE染色，光鏡下觀察。

1.2.4 Western blotting檢測PPARγ蛋白表達(dá) 在加入細(xì)胞裂解液后，將主動脈勻漿，提取總蛋白，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白測定，取60μg蛋白，配成20μl體系。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后置于PPARγ一抗（稀釋度為1∶1 000），4℃孵育過夜。取出PVDF膜，洗膜5min×6次，加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育2h。TBST洗膜5min×6次，用ECL發(fā)光液（試劑A∶試劑B=1∶1）覆蓋膜，曝光后進(jìn)行分析計(jì)算。

1.2.5 Real-time PCR檢測AdipoR1/2 mRNA的表達(dá) 用Trizol一部法抽提總mRNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR引物序列：AdipoR1上游引物5＇-TGGGGAAAAAATTATGAACTGG-3＇，下游引物5＇-GTGTGCTACAAAAATGGATGGC-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為132bp；AdipoR2上游引物5＇-TGCGCACACGTTTCAGTCTCCT-3＇，下游引物5＇-TTCTATGATCCCCAAAAGTGTGC-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為150bp；β-actin上游引物5＇-GCAGAAGGAGATCACAGCCCT-3＇，下游引物5＇-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為136bp。配置20μl PCR反應(yīng)體系，用LightCycler 480 PCR儀檢測。擴(kuò)增條件為：95℃5s，60℃1min，72℃30s，共40個循環(huán)；Ct值為每個管內(nèi)熒光信號達(dá)到預(yù)先設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。記錄LightCycler 480軟件中各指標(biāo)與內(nèi)參的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，以表示，兩組比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠主動脈形態(tài)學(xué)改變 正常組大鼠主動脈內(nèi)皮完整光滑，平滑肌分布均勻，未見增生；模型組大鼠平滑肌增生，內(nèi)膜明顯增厚，細(xì)胞腫脹肥大，排列紊亂，脂質(zhì)空泡化；紅曲組平滑肌增生不明顯，內(nèi)皮尚完整，細(xì)胞偶有排列不規(guī)則（圖1）。

圖1 各組主動脈形態(tài)學(xué)改變（A：正常組；B：模型組；C：紅曲組；HE染色，×200）

2.2 各組大鼠血脂水平比較 見表1、2。

表1 喂養(yǎng)12周后各組大鼠血脂水平比較（mmol/L）

表2 灌胃干預(yù)4周后各組大鼠血脂水平比較（mmol/L）

由表1、2可見，喂養(yǎng)12周后，高脂組大鼠TG、TC、LDL-C較正常組升高（均P＜0.01），HDL-C較正常組降低（P＜0.05）。經(jīng)灌胃干預(yù)4周后，模型組TG、TC、LDL-C較正常組升高（均P＜0.01），HDL-C較正常組降低（P＜0.05）；而紅曲組TG、TC、LDL-C較模型組降低（P＜0.01或0.05），HDL-C較模型組升高（P＜0.05）。

2.3 紅曲對大鼠主動脈PPARγ蛋白表達(dá)的影響 紅曲組PPARγ蛋白相對表達(dá)量為0.913±0.112、模型組為0.505±0.024、正常組為1.432±0.132，模型組PPARγ表達(dá)較正常組減少（P＜0.01），使用紅曲干預(yù)后PPARγ表達(dá)較模型組明顯增加（P＜0.01），見圖2。

圖2 紅曲對高脂血癥大鼠主動脈PPARγ蛋白相對表達(dá)量的影響

2.4 各組血清脂聯(lián)素和AdipoR1/AdipoR2 mRNA的表達(dá)情況 見表3。

表3 各組血清脂聯(lián)素和AdipoR1/AdipoR2 mRNA的表達(dá)情況

由表3可見，與正常組比較，模型組血清脂聯(lián)素、AdipoR1和AdipoR2 mRNA水平下降（P＜0.01或0.05），紅曲組脂聯(lián)素、AdipoR1和AdipoR2 mRNA水平較模型組升高（P＜0.05或0.01）。

3 討論

紅曲是在經(jīng)過蒸煮的糧食或利用天然菌種（霉菌、細(xì)菌、酵母菌）培養(yǎng)發(fā)酵形成的。紅曲作為一種混合微生物發(fā)酵劑，其在發(fā)酵過程中的各種代謝產(chǎn)物具有顯著的醫(yī)療作用。紅曲霉產(chǎn)生的物質(zhì)如阿魏酸及其衍生物，具有抗氧化、抗癌、抗菌及調(diào)控血壓等效果[5]。在清酒的發(fā)酵過程中，酒曲分泌的葡萄糖苷酶則具有護(hù)肝和加強(qiáng)角質(zhì)分化形成細(xì)胞的功效。20世紀(jì)70年代日本學(xué)者Endo從紅曲米中發(fā)現(xiàn)了能夠降低人體血清膽固醇的天然他汀類物質(zhì)Monacolin K[6]，引起了全世界對紅曲的關(guān)注。功能紅曲的主要成分Monacolin K的開環(huán)酸形式與HMG-CoA結(jié)構(gòu)相似，因此能夠競爭性地與HMGCoA還原酶結(jié)合從而抑制體內(nèi)膽固醇的合成過程，阻斷細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA向甲羥戊酸轉(zhuǎn)化，抑制膽固醇的合成[7-8]。

PPARs是一類受過氧化物酶體增殖物激活的核受體，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用。PPARs根據(jù)不同的結(jié)構(gòu)和功能分為α、β、γ三種亞型。PPARγ主要在胰島素的相關(guān)靶組織（脂肪、肝臟、骨骼?。┲斜磉_(dá)，可被多種脂肪酸及相關(guān)衍生物激活，是體內(nèi)脂肪酸的感受器。PPARγ被激活后，可以調(diào)節(jié)某些特定的基因轉(zhuǎn)錄以及誘導(dǎo)一系列脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的表達(dá)，以減少脂質(zhì)代謝負(fù)荷，改善脂肪變性[9]。有研究發(fā)現(xiàn)由美國默莎東公司化學(xué)合成的洛伐他汀可以通過上調(diào)PPARγ等的表達(dá)阻止ApoE基因敲除老鼠的動脈硬化及膽固醇在泡沫細(xì)胞的聚集[10]。脂聯(lián)素是體內(nèi)脂肪組織中含量最豐富的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，也是唯一與體脂含量呈負(fù)相關(guān)的脂肪因子。它可以抑制肝臟脂肪合成，促進(jìn)脂肪氧化分解，增強(qiáng)周圍組織對胰島素的敏感性，抑制炎癥因子產(chǎn)生，對抗氧化應(yīng)激和纖維化。臨床研究顯示低水平的脂聯(lián)素是高血壓、冠心病、糖尿病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；而高水平的TG與低脂聯(lián)素水平密切相關(guān)，易出現(xiàn)血管損傷，加速動脈粥樣硬化[11]。同時實(shí)驗(yàn)研究也提示脂聯(lián)素在高血壓、心血管疾病和胰島素抵抗的發(fā)展中起著保護(hù)作用[12]。有研究對于血脂異常的非糖尿病患者給予阿托伐他汀（一種新型的HMG-CoA還原酶抑制劑）治療后其血清脂聯(lián)素水平明顯升高，總膽固醇和低密度脂蛋白均不同程度降低[13]。

噻唑烷二酮類（TZDs）（如吡格列酮和曲格列酮）是合成的PPARγ選擇性激動劑，它與PPARγ結(jié)合后可以促使與胰島素抵抗相關(guān)的脂肪因子（如脂聯(lián)素、抵抗素、TNF-α等）的表達(dá)與釋放。Maede等[14]在一組輕度超重的糖耐量異?；颊咧袘?yīng)用曲格列酮治療1～2周后發(fā)現(xiàn)受試者血漿脂聯(lián)素水平明顯升高。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠在使用了吡格列酮進(jìn)行干預(yù)后其血脂降低，脂聯(lián)素受體AdipoR1/2 mRNA明顯升高[15]。而在參與動脈粥樣硬化形成的單核巨噬細(xì)胞使用PPARγ激動劑可上調(diào)AdipoR1/2的表達(dá)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，紅曲能降低血脂，逆轉(zhuǎn)主動脈的病理改變，增加PPARγ的表達(dá)，同時可以提高脂聯(lián)素的水平和促進(jìn)AdipoR1/2 mRNA表達(dá)，提示紅曲可能通過PPARγ對脂聯(lián)素及其相關(guān)受體進(jìn)行調(diào)控從而發(fā)揮降脂作用。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)紅曲作為天然來源的他汀類物質(zhì)具有明顯降脂作用，這可能與紅曲作用后可以提高PPARγ表達(dá)和增加血清脂聯(lián)素及AdipoRmRNA水平有關(guān)。近年來，許多的紅曲制劑如脂必妥、紅曲膠囊、血脂康膠囊等相繼投入國內(nèi)市場，它們不僅具有較好的降脂效果，且作用緩和、不良反應(yīng)小。因此，紅曲防治高脂血癥及其相關(guān)疾病具有現(xiàn)實(shí)意義及廣闊前景。

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Effect of red kojic rice on expression of PPARγ and adiponectin receptors in hyperlipidemic rats

Objective To investigate the effect of red kojic rice on expression of aorta peroxidase proliferator-activated receptor γ(PPARγ)and adiponectin receptor 1 and adiponectin receptor 2(AdipoR1 and AdipoR2)mRNA in hyperlipidemic rat．Methods Thirty-six SPF male SD rats were randomly divided into control group(n=12)and hyperlipidemia group(n=24)．Hyperlipidemia was induced by feeding high-fat diet for 12 weeks．The hyperlipidemic rats were further divided into model group and treatment group (n=12 in each group),rats in two groups were given 0．9%normal saline and red kojic rice by gavage for 4 weeks, respectively．Serum lipid levels were measured and pathological changes in aorta were observed with HE staining．The expression of PPAR γ was detected by Western blotting;serum adiponectin was measured by ELISA;AdipoR1 and AdipoR2 mRNA was detected by real time RT-PCR．Results After twelve weeks of high fat feeding,the triglyceride (TG),total cholesterol(TC)and low density lipoprotein cholesterol(LDL-C)in hyperlipidemia group increased significantly (P＜0．01),and high density lipoprotein cholesterol(HDL-C)decreased (P＜0．05)．Four weeks after administration,compared with the model group,the TG,TC and LDL-C in the treatment group were significantly decreased(P＜0．01 or 0．05),while HDL-C increased(P＜0．05)．The aortic intimal thickening and the proliferation of smooth muscle cells were decreased,the expression of PPAR γ and AdipoR1/AdipoR2 mRNA was increased in treatment group compared to model group．Conclusion Red kojic rice can lower the levels of blood lipids in hyperlipidemic rats,which may be related to u aortic PPARγ protein expression and AdipoR1/AdipoR2 mRNA expression．

Hyperlipidemia Aorta Red kojic rice Peroxidase proliferator-activated receptor γ Adiponectin Adiponectin receptor

2014-04-14）

（本文編輯：楊麗）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)溫州市第三臨床學(xué)院、溫州市人民醫(yī)院中醫(yī)科（林希、周毅、徐苗苗、林祥、邵深深、朱雪瓊）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科（郎瑋）

郎瑋，E-mail：Langwei808@126.com