李柏穎 宋康 夏永良 楊珺超 石亞杰

虎杖對肺纖維化大鼠肺組織中SOD、GSH、MDA的影響

李柏穎 宋康 夏永良 楊珺超 石亞杰

目的 通過觀察虎杖干預(yù)后肺纖維化大鼠肺組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性及谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量的影響，探討虎杖防治肺纖維化的作用機(jī)制。方法健康雄性SD大鼠120只，隨機(jī)分為5組：模型組30只，氣管內(nèi)一次性注入博萊霉素50．5mg/100g制作肺纖維化大鼠模型，當(dāng)日予0．9%氯化鈉溶液5ml/100g灌胃；預(yù)防組30只，于造模前2d開始予虎杖5ml/100g灌胃；肺泡炎組20只，于造模后第7天開始虎杖灌胃；肺纖維化組10只，于造模后第28天開始虎杖灌胃；對照組30只，于造模當(dāng)日開始0．9%氯化鈉溶液5ml/100g灌胃。各組大鼠灌胃均1次/d。5組大鼠分別于第3、7、14、28、42或56天分階段處死5只，取肺組織制成勻漿，測定SOD活性及GSH、MDA的含量。結(jié)果模型組第3、7、14天肺組織中SOD活性及GSH含量低于對照組（均P＜0．05），預(yù)防組上述指標(biāo)較模型組升高（P＜0．05或0．01），肺泡炎組、肺纖維化組與模型組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0．05）。模型組第7、14天肺組織中MDA含量明顯高于對照組和預(yù)防組（均P＜0．05）。結(jié)論虎杖能通過增強(qiáng)肺組織局部抗氧化能力，減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺泡炎和肺纖維化程度，可能是治療肺纖維化的有效藥物。

流浸膏 虎杖 肺纖維化 自由基 超氧化物歧化酶 谷胱甘肽 丙二醛

肺纖維化可由多種疾病引起，是病變發(fā)展過程中的一個階段，其病因諸多，發(fā)病機(jī)制、病理改變、自然演變過程、治療方法和預(yù)后均有不同。然而，肺纖維化臨床表現(xiàn)相似，包括活動性呼吸困難、X線胸片示彌漫性浸潤陰影、限制性通氣障礙、彌散功能降低和低氧血癥。虎杖為蓼科多年生草本植物虎杖的根莖，具有清熱解毒、清肺祛痰的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，虎杖的鞣質(zhì)具有抗氧化作用，能清除生物體內(nèi)過剩自由基。因此我們選用虎杖對肺纖維化大鼠進(jìn)行早期干預(yù)，動態(tài)觀察肺纖維化大鼠肺組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量的變化，探討虎杖防治肺纖維化的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD大鼠120只，體重（200±10）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 使用藥物 博萊霉素（15mg/支，批號640120）由日本化藥株式會社提供；虎杖流浸膏（虎杖生藥2.88g/ ml）由浙江省中醫(yī)院制劑室提供。

1.1.3 主要試劑和儀器 大鼠SOD、GSH、MDA試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；OLYMPUS BX40顯微攝像系統(tǒng)由日本OLYMPUS公司提供。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組及給藥方法 120只大鼠隨機(jī)分成5組：（1）模型組30只，氣管內(nèi)一次性注入博萊霉素50.5mg/100g（每支博來霉素以0.9%氯化鈉注射液0.3ml溶解），制作肺纖維化動物模型，造模當(dāng)日開始予0.9%氯化鈉溶液5ml/100g灌胃；（2）預(yù)防組30只，博萊霉素造模，于造模前2d開始予虎杖5ml/100g灌胃；（3）肺泡炎組20只，博萊霉素造模，于造模后第7天開始予虎杖5ml/100g灌胃；（4）肺纖維化組10只，博萊霉素造模，于造模后第28天開始予虎杖5ml/100g灌胃；（5）對照組30只，氣管內(nèi)一次性注入0.9%氯化鈉溶液0.3ml，當(dāng)日開始予0.9%氯化鈉溶液5ml/100g體重灌胃。對照組、模型組及預(yù)防組分別于3、7、14、28、42、56d各處死5只，肺泡炎組于14、28、42、56d各處死5只，肺纖維化組于42、56d各處死5只。

1.2.2 標(biāo)本收集與檢測 右肺制成10%肺組織勻漿，離心后取上清液，按試劑盒要求檢測肺組織勻漿中SOD活性及GSH、MDA的含量；左肺10%甲醛固定，HE染色和Masson染色，光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.2.3 療效判斷方法 （1）病理組織學(xué)觀察：根據(jù)Szapiel等[1]的方法將肺泡炎分為4級，即無肺泡炎（-）：計(jì)0分；輕度肺泡炎（+）：肺泡隔因炎性細(xì)胞浸潤增寬，受累范圍＜全肺20%，計(jì)1分；中度肺泡炎（++）：受累范圍達(dá)全肺20%～40%，計(jì)2分；重度肺泡炎（+++）：病變呈彌漫性分布，受累范圍＞全肺50%，計(jì)3分。（2）形態(tài)定量分析：利用Masson染色切片將肺纖維化分為4級，即無纖維化（-）：計(jì)0分；輕度纖維化（+）：受累范圍＜全肺20%，計(jì)1分；中度纖維化（++）：受累范圍達(dá)全肺20%～50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，計(jì)2分；重度肺纖維化（+++）：受累范圍＞全肺50%，肺泡融合，肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，計(jì)3分。每組單個病理計(jì)分相加為該組的病理積分?jǐn)?shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

圖1 模型組第7天時肺組織病理檢查所見（HE染色，×100）

圖2 模型組第14天時肺組織病理檢查所見（Masson染色，×100）

圖3 模型組第28天時肺組織病理檢查所見（Masson染色，×100）

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)觀察 見圖1-3。

由圖1可見，模型組第3～7天主要是以巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的大量炎性細(xì)胞浸潤，伴有肺泡隔增寬；由圖2可見，第14天較第7天時肺泡炎加重，肺纖維化增加；由圖3可見，第28天少量炎性細(xì)胞浸潤，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔明顯縮小，肺間質(zhì)被膠原纖維和成纖維細(xì)胞替代，肺間質(zhì)纖維化形成。

2.2 5組大鼠肺泡炎及肺纖維化組織病理積分比較 見表1。

由表1可見，模型組在各時期肺泡炎病理積分均明顯高于同時期對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肺纖維化病理積分亦高于同時期對照組，且在第14、28、42、56天時差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。預(yù)防組第3、7、14天肺泡炎病理積分均明顯低于同時期模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其肺纖維化病理積分在第28、42天時均明顯低于同時期模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺泡炎組第14天肺泡炎病理積分及第28、42天肺纖維化病理積分均明顯低于同時期模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺纖維化組第42天肺纖維化病理積分明顯低于同時期模型組。

2.3 5組大鼠各時期肺組織中SOD活性的變化 見表2。

由表2可見，模型組肺組織SOD活性在第3、7、14天時明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；預(yù)防組SOD活性在第7、14天時明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肺泡炎組和肺纖維化組的各時期SOD活性與同時期對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 5組大鼠各時期肺組織中GSH含量變化 見表3。

由表3可見，模型組肺組織GSH含量在第3、7、14天時明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；預(yù)防組GSH含量在第7、14天時明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肺泡炎組和肺纖維化組各時期GSH含量與同時期對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 5組大鼠各時期肺組織中MDA含量的變化 見表4。

由表4可見，模型組肺勻漿MDA含量在第7、14天時明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；預(yù)防組MDA含量在第7、14天明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肺泡炎組和肺纖維化各時期MDA與同時期模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 5組大鼠肺泡炎及肺纖維化病理積分比較

表2 5組大鼠各時期肺組織中SOD活性的變化（U/mgprot）

3 討論

肺纖維化的發(fā)病機(jī)制及治療一直是人們的研究熱點(diǎn)。目前把肺纖維化發(fā)病機(jī)制概括為肺泡炎，肺實(shí)質(zhì)損傷，過度的修復(fù)和纖維化這些階段[1]。近年來研究表明[2]，機(jī)體氧化/抗氧化的失衡啟動了肺泡炎的發(fā)生，肺泡炎引起的中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞淋巴細(xì)胞浸潤一方面加重了氧化損傷，另一方面釋放各種成纖維化細(xì)胞因子，刺激形成肺纖維化。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，在特發(fā)性肺纖維化中存在氧化過度和抗氧化不足的現(xiàn)象。牛建昭等[3]研究發(fā)現(xiàn)博萊霉素誘發(fā)大鼠肺纖維化時，可引起大鼠體內(nèi)自由基代謝水平異常。劉瑞等[4]研究發(fā)現(xiàn)，博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化過程中肺組織勻漿MDA含量、SOD活性、GSH/GSSG比值等各指標(biāo)在不同時間點(diǎn)出現(xiàn)變化。

正常肺組織內(nèi)存在完整的抗氧化體系，包括GSH、SOD等?；钚匝踉诜谓M織內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生并具有生理作用，但當(dāng)其產(chǎn)生過量且機(jī)體的抗氧化能力不足時，可損傷DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及碳水化合物，引起GSH、SOD等抗氧化物質(zhì)在此過程中被大量消耗[5]。機(jī)體在氧化/抗氧化的過程中，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化物，其中包括MDA，通過測試MDA的含量可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度。博萊霉素致肺損傷的過程和可能機(jī)制為：氧化還原反應(yīng)形成氧化劑，直接引起肺損傷，同時引起炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在肺泡和肺間質(zhì)聚集，釋放活性氧進(jìn)一步加重肺損害。此后炎性細(xì)胞分泌大量促纖維化因子，導(dǎo)致纖維組織增生、細(xì)胞外基質(zhì)沉積而形成后期肺纖維化[6]。

表3 5組大鼠各時期肺組織GSH含量的變化（mg/mgprot）

表4 5組大鼠各時期肺組織MDA含量的變化（nmol/mgprot）

虎杖抗氧化作用的成分主要是鞣質(zhì)，鞣質(zhì)具有多酚羥基結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的化學(xué)和生理活性[7]。鞣質(zhì)對脂質(zhì)過氧化的影響在于鞣質(zhì)的大量酚羥基與脂質(zhì)可以氫鍵的形式發(fā)生多點(diǎn)結(jié)合，從而阻礙了自由基對脂質(zhì)的攻擊；另一方面鞣質(zhì)結(jié)構(gòu)中較多的酚羥基使得鞣質(zhì)具有強(qiáng)還原性，能與自由基直接作用，從而起到清除生物體內(nèi)過剩自由基的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，經(jīng)氣管內(nèi)注入博萊霉素后第3天時，模型組大鼠肺組織勻漿中SOD活性明顯低于對照組，但模型組與預(yù)防組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；第7天時，模型組大鼠肺組織勻漿中SOD活性明顯仍低于對照組，預(yù)防組大鼠肺組織勻漿中SOD活性明顯回升，明顯高于模型組，與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；第14天時，模型組肺組織勻漿中SOD活性明顯回升，但仍明顯低于預(yù)防組和對照組，第28、42、56天時，各組的SOD活性已無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。大鼠肺組織勻漿中GSH含量在各時間點(diǎn)與SOD呈一致的變化。第3天時，模型組大鼠肺組織勻漿中MDA的含量與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第7、14天時，模型組大鼠肺組織勻漿中MDA的含量明顯高于對照組和預(yù)防組；第28、42、56天時，各組的MDA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示，在早期肺泡炎階段，由于博萊霉素直接的氧化損傷作用，導(dǎo)致肺組織中的SOD和GSH大量的消耗，從而造成肺組織的炎癥損傷，這種炎癥損傷通過MDA的含量得到證明，并且這種氧化/抗氧化的失衡持續(xù)到第14天；而預(yù)防組可能由于虎杖的抗氧化作用，提高局部的SOD活性，減少GSH的消耗及MDA的產(chǎn)生，從而減輕了肺組織的損傷；同樣，通過肺組織病理檢查發(fā)現(xiàn)，模型組氣管內(nèi)注入博來霉素后，第3、7、14天時以巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤及肺組織水腫和毛細(xì)血管增生較預(yù)防組明顯，說明虎杖在肺間質(zhì)纖維化初期具有抑制肺泡炎的發(fā)生和延緩肺泡炎發(fā)展的作用；而這種作用可能的機(jī)制是通過調(diào)整肺組織內(nèi)的氧化/抗氧化失衡抑制了炎癥細(xì)胞在肺組織內(nèi)的浸潤。在后期第28、42、56天時，各組的SOD和GSH含量均處于正常水平，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時MDA的含量也已恢復(fù)正常，說明在肺纖維化形成的后期，氧化/抗氧化失衡已糾正，不是疾病繼續(xù)發(fā)展的主要因素。病理觀察發(fā)現(xiàn)，預(yù)防組后期肺纖維化程度明顯較模型組輕，并且在肺泡炎組和肺纖維化組中，其肺纖維化的程度較模型組均有不同程度的減輕，說明預(yù)防組可能由于虎杖調(diào)整肺組織內(nèi)的氧化/抗氧化失衡抑制了炎癥細(xì)胞在肺組織內(nèi)的浸潤，從而減少了成纖維細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制了后期成纖維化的形成；肺泡炎組和肺纖維化組早期沒有虎杖的干預(yù)，因此其抗纖維化的作用不可能通過調(diào)整氧化/抗氧化的失衡而達(dá)到，說明虎杖可能有另外的抗纖維化形成的機(jī)理，有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，虎杖在調(diào)節(jié)氧化/抗氧化失衡中發(fā)揮作用，能夠防治早期肺泡炎的發(fā)生，并能延緩肺泡炎的發(fā)展及肺纖維化的形成。由此我們推斷，以虎杖為代表的同時具有清熱解毒和活血化瘀功效的這類中藥可能能夠預(yù)防和治療肺纖維化。

[1]朱元玨,陳文彬．呼吸病學(xué)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社,2003：1071-1081．

[2]Henn V,Slupsky J R,Grafe M,et al．CD40 ligand on activated platelets triggers and inflammatory reaction of endothelial cells[J]．Natrue,1998,391(6667)：591-594．

[3]牛建昭,張偉東,付敏,等．復(fù)方鱉甲軟肝方防治肺纖維化大鼠自由基損傷作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中草藥,2005,36(10)：1510-1514．

[4]劉瑞,李成剛,梁欣,等．博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化過程中羥脯氨酸及氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化[J]．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2004,25(23)：2202-2204．

[5]Cortijio J,Cerda-Nicola M,Serrano A,et al．Attenuation by oral N-acetylcysteine of bleomycin induced Lung injury in rats[J]．Eur Respir J,2001,17：1228-1235．

[6]程真順,徐啟勇,葉燕青,等．鹽酸氨溴索對肺纖維化大鼠的作用[J]．臨床內(nèi)科雜志,2003,20(4)：213．

[7]馮衛(wèi)生．鞣質(zhì)類化合物的生物活性研究進(jìn)展[J]．中國醫(yī)藥情報,1996,2 (4)：220-224．

Effect of Rhizoma Polygoni Cuspidati on SOD，GSH and MDA contents in lung tissue of rats with bleomycetin-induced pulmonary fi-brosis

Objective To evaluate the effects Rhizoma Polygoni Cuspidati on SOD,GSH and MDA contents in lung tissue of rats with bleomycetin-induced pulmonary fibrosis．MethodsOne hundred and twenty healthy male SD rats were randomly divided in to 5 groups．Pulmonary fibrosis model was induced by intratracheal infusion of 50．5mg/100g bleomycetin．Rats in model group(n=30)were instilled with saline 5ml/d by gavage after bleomycetin was infused;rats in preventive group(n=30)were treated with liquid extract of Rhizoma Polygoni Cuspidati 2d before bleomycetin infused;rats in alveolitis group(n=20)and pulmonary fibrosis group(n=10)were treated with liquid extract of Rhizoma Polygoni Cuspidati 7d after bleomycetin infused;rats in control group(n=30)were instilled with saline 5ml/d．Five rats in each group were sacrificed on d3,7,14,28,42 and 56,and lung samples were collected．The contents of SOD,GSH and MDA in lung homogenate were assayed．ResultsThe levels of SOD and GSH on d 3,7 and 14 were lower in model group than those in control group(P＜0．05)and preventive group(P＜0．05);the levels of MDA on d7 and 14 were higher in model group than those in control group and preventive group(P＜0．05)．ConclusionLiquid extract of Rhizoma Polygoni Cuspidati has anti-oxidant effects,which is associated with the alleviation of alveolitis pulmonary fibrosis induced by bleomycetin in rats．

Liquid extractRhizoma polygoni cuspidatiPulmonary fibrosis Anti-oxidantSOD GSH MDA

2013-08-13）

（本文編輯：楊麗）

310003 杭州市紅十字會醫(yī)院呼吸科（李柏穎）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科（宋康、楊珺超）、中醫(yī)科（夏永良）；杭州市中醫(yī)院呼吸科（石亞杰）