王子見 吳文成

摘 要：脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)III型（SCA3）是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)退行性疾病，目前尚無有效的治療藥物，只能通過某些藥物緩解癥狀。硫酸博萊霉素也稱博萊霉素（Bleomycin），用于治療腫瘤，其作用機(jī)制涉及自噬，氧化應(yīng)激等途徑，而這2個通路在SCA3致病過程起重要作用。該研究采用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）探索博萊霉素對突變ataxin-3引起的細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在藥物處理2h后，博萊霉素對SCA3細(xì)胞沒有毒性作用，也沒有抑制細(xì)胞凋亡的作用；在藥物處理24h后，在1000μM濃度時，博萊霉素對SCA3細(xì)胞有顯著毒性作用。該研究不僅豐富了舊藥新發(fā)現(xiàn)，也為神經(jīng)退行性疾病治療提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：硫酸博萊霉素；脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)III型；細(xì)胞凋亡

中圖分類號 R744.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）20-0032-3

Effect of Bleomycin Sulfate on the Apoptosis Induced by Ataxin-3

Wang Zijian et al.

（College of Biological and Environmental Engineering，Xian University，Xian 710065，China）

Abstract： Spinocerebellar ataxia type 3 is an autosomal dominant neurodegenerative disorder.There is no effective treatment at present，but it can be relieved by several medications.Bleomycin sulfate，also known as bleomycin，is used to treat tumors partly via autophagy and oxidative stress pathway which play an important role in SCA3. This study assesses the effect of bleomycin on the apoptosis induced by mutant ataxin-3 by MTT assay. The experimental results showed that after 2 hours of drug treatment，bleomycin did not show the did not inhibit the apoptosis.24 hours after the drug treatment，the apoptosis was enhanced by bleomycin at a concentration of 1000μM. This investigation provides new function of old drug and also supplies a proof for neurodegeneration diseases in further studies.

Key words：Bleomycin sulfate；Spinocerebellar ataxia type 3；Apoptosis

遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)（Spinocerebellar ataxias，SCAs）是一類影響人類神經(jīng)系統(tǒng)的遲發(fā)型神經(jīng)退行性疾病，其具有動態(tài)突變的特征，致病機(jī)理復(fù)雜，由三核苷酸動態(tài)突變擴(kuò)展引起[1]，呈常染色體顯性遺傳，臨床上具有多種表現(xiàn)特征，如共濟(jì)失調(diào)、弓形足、視神經(jīng)萎縮、脊柱側(cè)彎、心肌病、認(rèn)知功能受損、眼肌麻痹、失明、痙攣、肌肉萎縮和感覺障礙等癥狀。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)SCA的臨床表現(xiàn)涉及到多個系統(tǒng)，除了影響小腦和脊髓之外，還影響其他區(qū)域如中樞和外周系統(tǒng)[2]。據(jù)報道，SCAs包括SCA1-14（無SCA9）13個亞型，其中發(fā)病率最高的是脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)Ⅲ型（SCA3）[3]，以痙攣性共濟(jì)失調(diào)為突出表現(xiàn)，發(fā)病方式呈家族性和發(fā)散性，疾病的相關(guān)基因是ATXN3，編碼的蛋白是ataxin-3[4]，該基因CAG重復(fù)擴(kuò)增，正常人CAG以12～42次為正常重復(fù)次數(shù)，患者為52～84次，SCA3患者診斷方法有臨床診斷和基因診斷2種。目前沒有有效的藥物對其進(jìn)行治療，臨床治療以延緩病情發(fā)展和對癥治療為主，以提高患者的生活質(zhì)量。硫酸博萊霉素是一種廣譜的抗腫瘤藥物，也用來誘導(dǎo)建立肺纖維化動物模型[5]。肺纖維化和自噬相關(guān)，自噬在肺纖維化和纖維增生性肺病的發(fā)病過程中可能起到了雙重作用，而氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、缺氧等因素也參與了肺纖維化發(fā)病過程[6]。在神經(jīng)退行性疾病中，尤其是SCA3，自噬和氧化應(yīng)激在突變蛋白核異位，形成的聚集體等發(fā)病過程中起到了重要作用[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過ataxin-3突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞），構(gòu)建SCA3細(xì)胞模型，采用MTT方法，研究博萊霉素對突變ataxin-3引起的細(xì)胞凋亡的影響。此課題揭示博萊霉素舊藥新作用，為SCA3/MJD疾病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 HEK293細(xì)胞由倫敦大學(xué)學(xué)院薛少安教授惠贈。peGFP-ataxin-3-77CAG質(zhì)粒由德國圖賓根大學(xué)Thorsten Schimdt博士惠贈。博萊霉素購自Selleck Chemical公司（Cat.No.S1214）。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和提取 取出感受態(tài)細(xì)胞DH5α（大腸桿菌）于冰上融化，加入質(zhì)粒，混勻，置于冰上30min；隨后42℃熱擊90s，迅速置冰上，加入不含抗生素的LB培養(yǎng)基混勻，37℃恒溫?fù)u床（150r）搖45min。取出菌液，劃線涂板，37℃倒置過夜培養(yǎng)；選取菌落進(jìn)行挑菌，PCR鑒定。將PCR鑒定成功的菌落挑出，加入培養(yǎng)基，37℃搖床（150r）搖菌過夜。次日，取出菌液，離心（2000r，10min），棄去上清液，按照GIAGEN plasmid mini kit試劑盒說明書提取質(zhì)粒，使用Nanodrop2000檢測質(zhì)粒濃度。

1.2.2 轉(zhuǎn)染與加藥 按照梭華sofast轉(zhuǎn)染試劑說明書，取2μg質(zhì)粒，3μL梭華sofast，100μL培養(yǎng)液，室溫靜置30min，加入到六孔板內(nèi)。24h后，轉(zhuǎn)移至96孔板，24h后加藥處理，DMSO為陰性對照組，只含細(xì)胞為未處理對照組，藥物時間分別為2h和24h。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCA3細(xì)胞模型的構(gòu)建 通過將ataxin-3-77Q質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，使其蛋白表達(dá)，構(gòu)建SCA3細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)染48h后，收集和裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，檢測細(xì)胞中含擴(kuò)增PolyQ的突變ataxin-3蛋白。Western blot結(jié)果顯示，HEK293細(xì)胞過表達(dá)ataxin-3-77Q蛋白，SCA3細(xì)胞模型構(gòu)建成功（圖1）。如圖1所示，采用ataxin-3蛋白抗體（1H9抗體）和β-actin蛋白抗體孵育，得到75KD大小的突變ataxin-3蛋白和42KD大小的β-actin蛋白，其中1-2是不同蛋白樣本。

2.2 博萊霉素處理SCA3細(xì)胞模型2h后的影響 加入不同濃度的溶解在水中的博萊霉素2h后，以陰性對照組水為對照，MTT結(jié)果顯示，博萊霉素濃度從1000μM到1μM時，細(xì)胞活性有上升的的趨勢，并且在藥物濃度為1μM時所對應(yīng)的OD值最高，即此濃度對應(yīng)的細(xì)胞凋亡數(shù)目最少（圖2）。但是通過獨(dú)立樣本T-檢驗(yàn)可知，該濃度和陰性對照組相比P=0.7096（P>0.05），無顯著性。因此，在藥物處理2h后，不同濃度的博萊霉素對SCA3細(xì)胞模型沒有毒性，對細(xì)胞活性也沒有顯著的影響。

2.3 博萊霉素處理SCA3細(xì)胞模型24h后的影響 博萊霉素處理SCA3細(xì)胞模型2h后，對細(xì)胞活性沒有顯著影響，因此繼續(xù)加大作用時間，將藥物處理細(xì)胞24h后觀察結(jié)果。以陰性對照組水為對照，MTT結(jié)果顯示，博萊霉素濃度從1000μM下降到0.01μM時，細(xì)胞活性有上升的的趨勢，但是，通過獨(dú)立樣本T-檢驗(yàn)可知，不同濃度和陰性對照組相比均P>0.05，仍無顯著性。但是，當(dāng)博萊霉素濃度在1000μM，能夠顯著增加細(xì)胞毒性（或增加細(xì)胞凋亡）（P<0.05）。因此，不同濃度的博萊霉素處理SCA3細(xì)胞模型24h后，對細(xì)胞活性沒有顯著影響，但是濃度在1000μM時，對細(xì)胞模型有毒性（圖3）。

3 結(jié)論與討論

脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)III型（SCA3）是由于ATXN3基因突變導(dǎo)致，會引起CAG重復(fù)序列異常增加，其表達(dá)出的蛋白質(zhì)異常，出現(xiàn)錯誤折疊，進(jìn)而形成核內(nèi)包涵體引起細(xì)胞凋亡。硫酸博萊霉素，是一種廣譜抗腫瘤藥，作用機(jī)制主要是通過與DNA結(jié)合引起核酸鏈斷裂，除此以外，該FDA藥物還涉及自噬，氧化應(yīng)激等途徑。重要的是該藥物可以通過血腦屏障，對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病意義重大?；谝陨侠碚?，本研究探索硫酸博萊霉素是否可能影響SCA3細(xì)胞活性。通過MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得出，以H2O為陰性對照組，加藥2h后，博萊霉素藥物處理組6個濃度與對照組作樣本T-檢驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)，P值均大于0.05，故無顯著性，表明不同濃度的藥物處理2h后對細(xì)胞沒有毒性；加藥處理24h后，博萊霉素藥物處理組6個濃度與對照組作樣本T-檢驗(yàn)時得出，濃度在1000μM時，可以顯著增加細(xì)胞毒性。因此，可以推斷，硫酸博萊霉素隨著加藥時間變長，其毒性效果變得更明顯，這為下一步進(jìn)行該藥物對ataxin-3核轉(zhuǎn)運(yùn)和聚集體的形成的影響等研究提供了濃度和作用時間參考依據(jù)。此外，在利用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析時，發(fā)現(xiàn)error bar個別偏大，特別是加藥處理2h的數(shù)據(jù)，這也可能是由于在加入MTT時，DMSO時并未完全使其混勻，會導(dǎo)致OD值有所變化。在最后棄去上清時，甲臜易被棄去從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差較大。綜上所述，硫酸博萊霉素對突變ataxin-3引起的細(xì)胞凋亡沒有顯著影響，在高濃度時還會產(chǎn)生細(xì)胞毒性。因此，下一步還需要探討該FDA藥物對SCA3細(xì)胞模型其他的病理變化，比如突變ataxin-3核異位以及形成的“有毒”包涵體的影響。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)編：張宏民）