張紅萍 馬衛(wèi)德 黃凌霄 張晨暉 李建新 張?jiān)螺x 鄭加永

妊娠期糖尿病患者核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1基因多態(tài)性研究

張紅萍 馬衛(wèi)德 黃凌霄 張晨暉 李建新 張?jiān)螺x 鄭加永

目的 了解妊娠期糖尿?。℅DM）患者核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（ENPP1）基因位點(diǎn)rs1044498 K121Q，rs7754561 A＞G+1044TGA和rs1799774 IVS20delT-11多態(tài)性的分布情況。方法選取94例GDM患者（GDM組）與94例健康孕婦（對照組）。采用聚合酶鏈反應(yīng)-高分辨率溶解曲線（PCR-HRM）技術(shù)檢測ENPP1基因位點(diǎn)rs1044498 K121Q，rs7754561 A＞G+1044 TGA和rs1799774 IVS20delT-11的3個基因型。樣本的群體代表性進(jìn)行哈丁溫伯格遺傳平衡（HWE）檢驗(yàn)；組間基因型頻率比較采用SPSS 20．0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，連鎖不平衡采用SHEsis軟件進(jìn)行分析。結(jié)果rs1044498的C等位基因在GDM組的頻率為68．1%高于對照組的12．2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；CC、AC基因型攜帶者患GDM的風(fēng)險(xiǎn)分別是AA基因型攜帶者的90．46和2．339倍。rs7754561的A等位基因在GDM組的頻率為43．1%高于對照組的32．4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；AA、AG基因型攜帶者患GDM的風(fēng)險(xiǎn)分別是GG基因型攜帶者的3．576和0．445倍。rs1799774等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，-|-基因型攜帶者患GDM的風(fēng)險(xiǎn)是TT型攜帶者的3．084倍，是Tdel+TT攜帶者的3．478倍。單倍型AAT、ACdel、GAT、GCT、ACT與GDM發(fā)病正相關(guān)（OR＞1）。結(jié)論rs1044498 K121Q和rs7754561 A＞G+1044TGA位點(diǎn)的基因多態(tài)性與GDM有關(guān)，rs1044498 C等位基因和rs7754561 A等位基因可能是導(dǎo)致GDM發(fā)病的高危因素。

妊娠期糖尿病 核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1 基因 多態(tài)性

妊娠期糖尿病（gestational diabetes，GDM）指妊娠過程中發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的糖尿病，是圍生期常見的并發(fā)癥，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)GDM家系中2型糖尿病或糖耐量損傷的比例較正常家系增高，GDM患者產(chǎn)后2型糖尿病的發(fā)生率升高，提示GDM和2型糖尿病之間有許多病理生理及生化方面的相似之處，以胰島素抵抗和胰島素分泌功能受損為特征。核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase1,ENPP1）為最近發(fā)現(xiàn)與胰島素抵抗及2型糖尿病相關(guān)的基因，其能水解磷酸二酯鍵和焦磷酸鍵，最終起到抑制胰島素的作用。Meyre等[3-5]發(fā)現(xiàn)ENPP1基因多態(tài)性與2型糖尿病有關(guān)，但ENPP1與GDM的相關(guān)性研究未見報(bào)道。故我們對溫州地區(qū)孕婦中ENPP1基因K121Q、IVS20delT-11及 A＞G+1044TGA多態(tài)性與GDM的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了研究，旨在為GDM高危人群的篩查和早期預(yù)防提供參考依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 2012-04—2013-04我院產(chǎn)前檢查的溫州地區(qū)188例漢族懷孕婦女，其中GDM孕婦94例（GDM組），健康孕婦（對照組）94例。GDM診斷參照2010年國際妊娠合并糖尿病研究組織（IADPSG）推薦標(biāo)準(zhǔn)：孕婦首次產(chǎn)前檢查時，F(xiàn)PG≤7.0mmol/L或隨機(jī)血糖≤11.1mmol/L；并于妊娠24～28周時，行OGTT，分別于空腹和服葡萄糖后1、2h測定血漿葡萄糖，其界限分別為5.1、10.0、8.5mmol/ L，任何1項(xiàng)血糖達(dá)到或超過上述標(biāo)準(zhǔn)即診斷為GDM。對照組要求FPG≤4.4 mmol/L。本研究經(jīng)溫州市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書，同意將其血樣用于本研究。

1.2 生理指標(biāo)測定及DNA提取 產(chǎn)前門診記錄孕前身高、體重，計(jì)算孕前BMI，采用BD真空采血系統(tǒng)抽取研究對象空腹靜脈血3ml，分成2管。其中促凝管收集血液2ml，靜置30min后，3 000r/min離心10min，分離血清用于測定血糖、TC、TG、HDL-C和LDL-C；另1管用EDTA抗凝管收集血液1ml，采用天根公司DNA提取試劑盒，提取基因組DNA，用超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度測定并標(biāo)化至50ng/μl，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因分型 參考NCBI Reference Assembly（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov）獲得K121Q、IVS20delT-11及A＞G+1044TGA 3個SNP附近基因序列信息。使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)SNP位點(diǎn)引物，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。采用高分辨率溶解曲線（HRM）法進(jìn)行基因分型，Type-it HRM PCR Kit試劑由QIAGEN公司提供。擴(kuò)增體系：體系總體積為10μl，其中HRM PCR Master Mix 5μl，DNA模板1μl，上下游引物個0.7μl。于Roche LightCycler480儀器擴(kuò)增，條件為95℃預(yù)變性5min；95℃10s，55℃30s，45個循環(huán)；65℃1s，65～95℃每升高0.02℃采集1次數(shù)據(jù)，獲得HRM曲線。PCR-HRM技術(shù)可直接將樣本分為野生型、雜合型突變和純合型突變3種基因型，每種基因型中挑選部分樣本進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證，HRM引物序列和測序引物序列見表1。

表1 HRM引物序列和測序引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析相對危險(xiǎn)度（OR）以及95%可信區(qū)間（CI），計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。采用SHEsis軟件（http://analysis.bio-x.cn/SHEsis-Main.htm）進(jìn)行連鎖不平衡分析，以P＜0.05說明存在連鎖不平衡；進(jìn)行單倍型分析，定義最低頻率閾值為0.03，即頻率＜0.03的單倍型不予考慮分析；進(jìn)行哈丁溫伯格遺傳平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）驗(yàn)證樣本的群體代表性，以P＞0.05為符合HWE定律。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料和生化指標(biāo)比較 見表2。

表2 兩組臨床資料和生化指標(biāo)比較

由表2可見，GDM組年齡明顯大于對照組（P＜0.05）。GDM組FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、孕前BMI與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。GDM組OGTT實(shí)驗(yàn)的1、2h血糖均較對照組高（均P＜0.01）。

2.2 HWE定律吻合度檢驗(yàn) 經(jīng)HWE檢驗(yàn)，在對照組SNP rs1044498、rs7754561、rs1799774多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率已經(jīng)達(dá)到遺傳平衡（P＞0.05），說明對照組入選人群具有群體代表性。

2.3 基因分型結(jié)果 見圖1。

圖1 ENPP1基因rs1044498、rs7754561及rs1799774基因型及測序

由圖1可見，通過HRM基因分型系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)SNP rs1044498、rs7754561和rs1799774均有3種基因型，并且每種基因型和未知基因型均得到Sanger測序的驗(yàn)證。

2.4 兩組ENPP1基因3個SNPs的等位基因和基因型分布結(jié)果的比較 見表3。

由表3可見，在等位基因中rs1044498的C等位基因在GDM組出現(xiàn)的頻率為68.1%，而對照組則為12.2%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；CC、AC基因型攜帶者患GDM的風(fēng)險(xiǎn)分別是AA基因型攜帶者的90.46（P＜0.01，OR=90.46，95%CI：20.46～399.9）和2.339倍（P＜0.05，OR=2.339，95%CI：1.015～5.388）；在顯性模型（CC+ AC、AA）分析中，C等位基因攜帶者（CC+AC）患GDM的風(fēng)險(xiǎn)是AA型攜帶者的10.73倍（P＜0.01，OR=10.73，95% CI：5.459～21.10）；在隱性模型（CC、AA+AC）分析中，CC基因型攜帶者患GDM的風(fēng)險(xiǎn)是（AA+AC）攜帶者的70.86倍（P＜0.01，OR=70.86，95%CI：16.44～305.5）。

rs7754561的A等位基因在GDM組出現(xiàn)的頻率為43.1%，對照組為32.4%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；AA、AG基因型攜帶者患GDM的風(fēng)險(xiǎn)分別是GG基因型攜帶者的3.576（P＜0.01，OR=3.576，95%CI：1.469～8.705）和0.445倍（P＜0.05，OR=0.445，95%CI：0.2272～0.8713）；在隱性模型（AA、AG+GG）分析中，AA基因型攜帶者患GDM的風(fēng)險(xiǎn)是（AG+GG）的5.039倍（P＜0.01，OR=5.039，95%CI：2.166～11.73）。

rs1799774等位基因頻率分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，-|-基因型攜帶者患GDM的風(fēng)險(xiǎn)是TT型攜帶者的3.084倍（P＜0.05，OR=3.084，95%CI：1.039～9.149），是Tdel+TT攜帶者的3.478倍（P＜0.05，OR=3.478，95%CI：1.229～9.843）。

2.5 SNP間連鎖不平衡分析和單倍型分析結(jié)果 見表4～5。

由表4～5可見，采用SHEsis軟件對3個SNPs進(jìn)行連鎖不平衡分析和單倍型分析得出3個SNPs間不存在連鎖不平衡，單倍型分析顯示AAT（rs1044498 A，rs7754561 A，rs1799774 T）、ACdel、GAT、GCT、ACT在GDM組出現(xiàn)頻率高于對照組。

3 討論

研究采用回顧性病例-對照設(shè)計(jì)分析了溫州地區(qū)94例GDM患者和94例健康妊娠孕婦ENPP1基因rs1044498、rs7754561及rs1799774多態(tài)性，研究結(jié)果顯示rs1044498 C等位基因和rs7754561 A等位基因可能與GDM有關(guān)。臨床資料顯示年齡是GDM發(fā)生的一個高危因素，與相關(guān)報(bào)道一致[6]。GDM是內(nèi)分泌代謝障礙性疾病，主要表現(xiàn)為糖代謝紊亂、脂代謝紊亂，有學(xué)者認(rèn)為GDM患者LDL、TG異常升高，孕早期TG的升高與GDM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[7]，然而研究中未發(fā)現(xiàn)BMI、血脂（TC、TG、HDL-C和LDL-C）等在GDM組和對照組中存在差異。

迄今為止，糖尿病已成為臨床上的主要內(nèi)分泌疾病，也成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病[8]。WHO糖尿病專家委員會提出糖尿病分為4大類，即1型糖尿病、2型糖尿病、GDM和特殊類型的糖尿病。GDM是僅次于2型糖尿病的第二常見類型糖尿病。Zhang等[9]對天津地區(qū)GDM發(fā)病率進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)從1999～2008年GDM發(fā)病率升高了2.8倍，由2.4%～6.8%。盡管人們對GDM的危害已有明確認(rèn)識[10]，但其發(fā)病機(jī)制的研究相對匱乏。全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）使得研究復(fù)雜疾病的靶基因成為可能，已有多個研究小組將GWAS應(yīng)用于2型糖尿病的研究，并發(fā)現(xiàn)了許多相關(guān)基因[8，11]。目前關(guān)于GDM的GWAS研究較為匱乏，基于GDM與2型糖尿病發(fā)病機(jī)理的相似性，研究將以2型糖尿病相關(guān)的基因做篩選點(diǎn)，了解其與GDM的關(guān)系。

ENPP1是一種廣泛表達(dá)的2型跨糖蛋白，屬于ENPP酶家族，具有水解核苷酸中5′磷酸二酯鍵的作用。Maddux首次發(fā)現(xiàn)ENPP1高表達(dá)導(dǎo)致胰島素受體功能受損，從而引發(fā)胰島素抵抗[12]，這一觀點(diǎn)也相繼被其他研究小組證實(shí)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)肝臟和肌肉組織中ENPP1的增加伴隨著機(jī)體的胰島素抵抗和高血糖的發(fā)生[13-14]。研究同樣發(fā)現(xiàn)ENPP1基因的突變導(dǎo)致糖耐量受損及2型糖尿病的發(fā)生[3，15]，如K121Q、IVS20delT-11、A＞G+ 1044TGA單核苷酸多態(tài)性。rs1044498 K121Q多態(tài)性位于ENPP1基因第4號外顯子上，Q121和K121兩個等位基因都可以直接作用于胰島素受體，但突變型Q121比野生型K121更強(qiáng)地抑制胰島素受體酪氨酸激酶活性，從而抑制胰島素作用。rs1799774 IVS20delT-11和rs7754561 A＞G+1044TGA屬于非編碼多態(tài)性，分別位于內(nèi)含子和3′非編碼區(qū)，其所起的功能未知，或許與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。研究是首次對rs1044498 K121Q，rs7754561 A＞G+1044TGA和rs1799774 IVS20delT-11多態(tài)性與GDM的關(guān)系進(jìn)行闡述，發(fā)現(xiàn)rs1044498 K121Q和rs7754561 A＞G+1044TGA位點(diǎn)基因多態(tài)性與GDM有關(guān)，提示rs1044498 C等位基因和rs7754561 A等位基因可能是GDM發(fā)病的高危因素。

表3 兩組ENPP1基因3個SNPs的等位基因和基因型分布結(jié)果的比較

表4 3個SNPs間連鎖不平衡分析

表5 GDM和對照組單倍型關(guān)聯(lián)分析[例（%）]

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（本文編輯：沈昱平）

“第三屆國際肝膽胰外科及微創(chuàng)外科大會”通知

由浙江省人民醫(yī)院和浙江省抗癌協(xié)會共同主辦，《中華醫(yī)學(xué)雜志》、《中華外科雜志》、《中華消化外科雜志》、《中華普通外科雜志》、《中華肝膽外科雜志》、《中國實(shí)用外科雜志》、《中國微創(chuàng)外科雜志》、《浙江醫(yī)學(xué)》（排名不分先后）編輯部共同協(xié)辦的第三屆國際肝膽胰外科和微創(chuàng)外科大會將于2014年12月12日至14日在杭州舉行。

本次大會將邀請美國、日本、新加坡、印度、香港、臺灣和中國大陸著名肝膽胰外科專家、學(xué)者、院士就肝膽胰外科發(fā)展的熱點(diǎn)、難點(diǎn)和發(fā)展趨勢進(jìn)行研討。會議內(nèi)容：大會學(xué)術(shù)報(bào)告、全國手術(shù)視頻總決賽和手術(shù)演示。手術(shù)演示內(nèi)容：達(dá)芬奇機(jī)器人肝膽胰外科手術(shù)、腹腔鏡胰十二指腸切除術(shù)、肝膽胰腫瘤納米刀治療、復(fù)雜肝膽胰外科手術(shù)。歡迎廣大外科同道積極投稿和參會。

征文要求：肝膽胰外科、微創(chuàng)外科的基礎(chǔ)和臨床研究。形式：手術(shù)視屏（光盤，錄像格式AVI、MPEG）、文字（word）或PPT三種形式。入選優(yōu)秀論文或視頻將在會上報(bào)告。注冊代表獲國家級繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育學(xué)分5分。

征文截止日期：2014年11月15日。會議聯(lián)系人：吳嘉（電話15858256026），張宇華（電話13588033123）。征文電子版發(fā)至郵箱：inthbp@163.com或zyhemail@hotmail.com或登陸網(wǎng)站注冊：www.inthbp.com

本刊編輯部

Association of ENPP1 polymorphisms with gestational diabetes mellitus

Objective To investigate the association of ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1(ENPP1) gene polymorphisms with the risk of gestational diabetes mellitus(GDM)．MethodsThe polymorphisms of ENPP1(rs1044498 K121Q,rs7754561 A＞G+1044TGA,rs1799774 IVS20delT-11)were genotyped by polymerase chain reaction-high resolution melt(PCR-HRM)method in 94 GDM women and 94 healthy pregnant women(control group)．Hardy-Weinberg equilibrium(HWE) test was used to evaluate the representative of the sample．Genotype frequencies between groups were compared with Chi-square test,SPSS 20．0．Linkage disequilibrium was tested using SHEsis．ResultsThe C allele of rs1044498 was significantly higher in GDM group than that in control group(0．681 vs．0．122,P＜0．01)．Compared with AA,the CC and AC genotype carriers had 90．46 and 2．339 times more susceptibility to GDM．The A allele of rs7754561 was higher in GDM group than that of control group(0．431 vs．0．324,P＜0．05）．Compared with GG,the AA and AG genotype carriers had 3．576 and 0．445 times more susceptibility to GDM．However,as for rs1799774,no significant difference was found in the distribution of the alleles between two groups,-|-genotype carriers were 3．084 times more susceptibility to GDM than TT carriers,and 3．478 times than TT+Tdel carriers．In addition,the AAT,ACdel,GAT,GCT,ACT haplotypes might contribute to susceptibility to GDM．ConclusionThe polymorphisms of ENPP1 genes rs1044498 and rs7754561 are likely to associated with GDM,the C allele of rs1044498 and A allele of rs7754561 may be risk factors for GDM．

GestationalDiabetes/ENPP1 Gene Polymorphism

2014-03-27）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生計(jì)劃項(xiàng)目（Y20080240）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y13H040024)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃平臺骨干人才項(xiàng)目(2013RCB015)

325000 溫州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科

鄭加永，E-mail：wryzheng@126.com