付慶霞， 王建成， 任繼東

（1.山東臨沂市人民醫(yī)院， 山東 臨沂 276003； 2.山東臨沂市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心， 山東 臨沂 276001）

銀菊散結(jié)口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

付慶霞1， 王建成2， 任繼東1

（1.山東臨沂市人民醫(yī)院， 山東 臨沂 276003； 2.山東臨沂市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心， 山東 臨沂 276001）

目的 建立銀菊散結(jié)口服液 （金銀花、 菊花、 桔梗、 玄參等） 的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 方法 采用薄層色譜法對(duì)金銀花、菊花、 桔梗進(jìn)行定性鑒別； 并采用 HPLC法同時(shí)測(cè)定金銀花與菊花中綠原酸及木犀草苷、 玄參中哈巴俄苷、 菊花中3，5-O-二咖啡?；鼘幩?。 結(jié)果 薄層色譜斑點(diǎn)清晰； 綠原酸、 木犀草苷、 哈巴俄苷、 3，5-O-二咖啡?；鼘幩岱謩e在 0.082 4 ～0.824 μg、 0.103 9 ～1.039 μg、 0.048 ～0.48 μg、 0.185 6 ～1.856 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系 （r分別為0.999 8、 0.999 9、 0.999 9、 0.999 9）， 平均回收率分別為 100.67%、 99.42%、 99.79%、 99.89%， RSD分別為0.75%、 1.46%、 0.81%、 0.63%。 結(jié)論 該方法可準(zhǔn)確用來定性、 定量檢測(cè)， 具有簡(jiǎn)便、 準(zhǔn)確及專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于銀菊散結(jié)口服液的質(zhì)量控制。

銀菊散結(jié)口服液； 綠原酸； 木犀草苷； 哈巴俄苷； 3，5-O-二咖啡?；鼘幩?； TLC； HPLC

銀菊散結(jié)口服液是臨沂市人民醫(yī)院經(jīng)山東省食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)生產(chǎn)的中藥制劑 （魯藥制字 Z20110003）， 由金銀花、 菊花、 桔梗、 玄參等中藥組方，具有解毒清熱，散結(jié)消癭的作用，臨床用于癭病，甲狀腺腫瘤、單純性甲狀腺腫大、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀腺機(jī)能減退、亞急性甲狀腺炎、慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎 （橋本甲狀腺炎） 見上述證候者； 亦用于 “乳癖”、 “癥瘕” 及 “經(jīng)斷前后諸證”，乳腺增生、卵巢囊腫、子宮腺肌病及更年期綜合征見于上述證候者。通過多年的臨床使用，療效可靠，大大填補(bǔ)了目前甲狀腺類疾病治療的市場(chǎng)空白。為控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量，對(duì)處方中的金銀花、桔梗進(jìn)行了薄層色譜鑒別，并采用高效液相色譜法測(cè)定了制劑中的綠原酸、木犀草苷、哈巴俄苷、 3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的量， 所建立的方法操作簡(jiǎn)便、分離效果好、重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，可以有效地控制本品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent1260 高效液相色譜儀， DAD二極管陣列檢測(cè)器， Agilent Chemistation 色譜工作站， KQ3200型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）， XS-205 型電子分析天平 （瑞士梅特勒公司）。

綠原酸、木犀草苷、哈巴俄苷、3，5-O-二咖啡酰 基 奎 寧 酸 對(duì) 照 品 （ 批 號(hào)： 110753-200413、111720-200501、 111730-201106、 111782-201203 ）。金銀花、 桔梗、 菊花對(duì)照藥材 （ 批號(hào)為 121028-200507、121028-200909、 121384-201103）。 對(duì)照品與對(duì)照藥材均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

銀菊散結(jié)口服液由臨沂市人民醫(yī)院委托魯南厚普有限公司生產(chǎn) （批號(hào)分別為 1107201、 1107202、1107203）。

乙腈 （色譜純， 山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司）， 娃哈哈純凈水 （杭州娃哈哈集團(tuán)）， 甲醇 （分析純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司）。 其他均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 金銀花與菊花的薄層鑒別［1]取本品 5 mL置10 mL量瓶中， 加乙醇至刻度， 搖勻，離心， 取上清液作為供試品溶液。另取綠原酸對(duì)照品，加甲醇制成每 1 m L含 0.1 mg的溶液， 作為對(duì)照品溶液。 再取金銀花對(duì)照藥材 0.2 g，加甲醇 5 mL，放置 12 h，濾過， 取濾液作為金銀花對(duì)照藥材溶液。最后， 取菊花對(duì)照藥材 1 g， 加石油醚 （30 ～60 ℃） 20 m L， 超聲處理 10 min， 棄去石油醚， 藥渣揮干， 加稀鹽酸 1 mL與乙酸乙酯 50 mL， 超聲處理 30 min， 濾過，濾液蒸干， 殘?jiān)蛹状?2 mL使溶解，作為菊花對(duì)照藥材溶液。照 《中國(guó)藥典》2010 年版一部附錄Ⅵ B薄層色譜法試驗(yàn)， 吸取供試品溶液 15 μL， 對(duì)照品溶液與對(duì)照藥材溶液各10 μL， 上述四種溶液分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板，以乙酸丁酯-甲酸-水 （7 ∶2.5 ∶2.5） 的上層溶液為展開劑，展 開，取 出，晾 干，置 紫 外 光 燈（365 nm） 下檢視。 供試品色譜中， 在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。缺金銀花、菊花陰性樣品無相應(yīng)斑點(diǎn)，見圖1。

2.2 桔梗的薄層鑒別［1]取本品 20 m L， 加 7%硫酸乙醇 5 mL， 加熱回流3 h， 放冷， 用三氯甲烷振搖提取2 次， 每次 20 m L， 合并三氯甲烷液， 加水3 mL洗滌， 棄去洗液， 三氯甲烷液用無水硫酸鈉脫水， 濾過，濾液蒸干， 殘?jiān)蛹状? m L使溶解，作為供試品溶液。 另取桔梗對(duì)照藥材 1 g， 加 7%硫酸乙醇-水 （1 ∶3） 20 mL， 同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 GF254薄層板上， 以三氯甲烷-乙醚 （1 ∶1） 為展開劑， 展開， 取出，晾干，置紫外光燈 （254 nm） 下檢視。 供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。 缺桔梗陰性樣品無相應(yīng)斑點(diǎn)， 見圖2。

3 4 種成分的同時(shí)測(cè)定［2-13］

3.1 色 譜 條 件 Agilent ZORBAX SB-C18色 譜 柱（5 μm， 4.6 mm×250 mm， 柱號(hào) 880975-902）； 以乙腈為流動(dòng)相 A， 0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相 B， 梯度洗脫， 0 ～30 min （9% ～18%A）， 30 ～33 min（18% ～25%A）， 33 ～36 min （25%A）， 36 ～38 min （25% ～30%A）， 38 ～40 min （ 30%A），40 ～50 min （30% ～50%A）， 50 ～60 min （50% A）。 柱溫 30 ℃； 綠原酸、 木犀草苷、 3，5-O-二咖啡?；鼘幩釞z測(cè)波長(zhǎng)為 348 nm， 哈巴俄苷為278 nm； 體積流量 1 mL/min； 理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算不低于 1 000、 木犀草苷峰不低于20 000，哈巴俄苷峰不低于 20 000， 3，5-O-二咖啡?；鼘幩岱宀坏陀?20 000。 色譜圖見圖3 ～4。

3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、 木犀草苷、 哈巴俄苷、 3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸對(duì)照品10.30、 12.99、 6.00、 23.20 mg， 置 250 mL量瓶中， 加80%甲醇制成混合對(duì)照品溶液， 即得。

3.3 供試品溶液的制備 取裝量項(xiàng)下的本品， 精密吸取 5 m L， 置 10 mL量瓶中， 加 50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

圖 3 哈巴俄苷測(cè)定 HPLC圖譜 （278 nm）Fig.3 HPLC chromatograms of harpagoside（278 nm）

3.4 陰性樣品溶液的制備 分別按處方比例及制劑制備工藝制備不含金銀花、菊花、玄參的陰性樣品， 再按 “3.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

3.5 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、 供試品溶液和陰性樣品溶液各 10 μL， 分別注入液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果金銀花、菊花、玄參陰性樣品分別在綠原酸、 木犀草苷、 哈巴俄苷、 3，5-O-二咖啡?；鼘幩嵯鄳?yīng)保留時(shí)間處未見色譜峰，表明陰性樣品對(duì)檢測(cè)無干擾。 見圖3～4。

圖 4 綠原酸、 木犀草苷、 3，5-0-二咖啡?；鼘幩釡y(cè)定HPLC圖譜 （348 nm）Fig.4 HPLC chromatograms of ch lorogenic acid， cynaroside and 3，5-0-dicaffeoyl quinic acid（348 nm）

3.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取綠原酸、 木犀草苷、 哈巴俄苷、 3，5-O-二咖啡?；鼘幩釋?duì)照品混合溶液 1、 2、 4、 8、 10、 20 μL， 注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，其回歸方程及線性范圍見表1。

表1 回歸方程和線性范圍Tab.1 Regression equations and linear ranges

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液，在上述色譜條件下于 1、 2、 3 日分別進(jìn)樣分析， 記錄各色譜峰面積值，并計(jì)算綠原酸、木犀草苷、哈巴俄苷、 3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬?RSD， 分別為0.85%、 0.76%、 1.12%、 1.03%， 結(jié)果表明供試品溶液在3日內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一批次樣品， 按照“3.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液， 在上述色譜條件下測(cè)定4種成分，平行操作6份，并計(jì)算綠原酸、 木犀草苷、 哈巴俄苷、 3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬?RSD， 分別為 1.20%、 1.40%、 0.95%、 3，5-O-二咖啡?；鼘幩釣?1.16%， 表明本方法重復(fù)性試驗(yàn)良好。

3.9 精密度試驗(yàn) 按照上述色譜條件， 精密吸取“3.3” 項(xiàng)下的方法制備的供試品溶液 10 μL， 注入高效液相色譜儀中，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算綠原酸、木犀草苷、 哈巴俄苷、 3，5-O-二咖啡?；鼘幩岱迕娣e 的 RSD， 分 別 為 0.20%、 0.45%、 0.68%、0.23%， 表明儀器精密度良好。

3.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取不同批次已知含有量的銀菊散結(jié)口服液樣品各 1 mL， 平行操作 6份，每份分別精密加入適量的固體對(duì)照品或?qū)φ掌啡芤海?置 100 mL量瓶中， 加 50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，取對(duì)照品溶液、加樣回收供試品溶液各5 μL， 分別注入液相色譜儀， 測(cè)定， 計(jì)算加樣回收率， 結(jié)果見表2。

3.11 樣品測(cè)定 取 3 批銀菊散結(jié)口服液， 按“3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀中，在上述相同色譜條件下記錄4種成分的峰面積值，通過回歸方程計(jì)算4種化合物的質(zhì)量濃度， 結(jié)果見表3。

表2 4種化合物回收率測(cè)定結(jié)果Tab.2 Resu lts of recovery tests for four com ponents

4 討論

4.1 色譜條件的選擇 通過 DAD檢測(cè)器光譜掃描與同時(shí)開通8個(gè)通道檢測(cè)，其最大吸收波長(zhǎng)分別為327 nm、 350 nm、 278 nm、 348 nm， 經(jīng)過系列實(shí)驗(yàn)，未能整合同一波長(zhǎng)下4種成分同時(shí)測(cè)定，故在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上， 綠原酸、木犀草苷、 3，5-O-二咖啡?；鼘幩徇x擇 348 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)， 因哈巴俄苷在 348 nm出現(xiàn)倒峰， 故選擇 278 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)， 根據(jù) AgilentDAD檢測(cè)器的特殊功能， 可并列開通 348 nm、 278 nm兩個(gè)通道同時(shí)檢測(cè) 4 種成分，從而達(dá)到4種成分同時(shí)檢測(cè)的效果。為保證4種成分同時(shí)檢出，采用了梯度洗脫，此兩個(gè)波長(zhǎng)下，基線平穩(wěn)，峰面積較大，色譜峰的峰形均較好。

4.2 提取條件的選擇 為保證 4 種成分的同時(shí)檢出，根據(jù)處方中的藥材量及實(shí)際檢測(cè)過程中的檢測(cè)濃度，僅對(duì)銀菊散結(jié)口服液樣品稀釋2倍，可大大減少前處理環(huán)節(jié)、提高檢驗(yàn)效率、節(jié)約試劑及降低檢驗(yàn)成本。

4.3 金銀花與桔梗的定性鑒別 根據(jù)配制工藝，對(duì)綠原酸的鑒別采用直接取樣稀釋的方式。因金銀花與菊花中皆有綠原酸，故在定性鑒別中采用金銀花和菊花對(duì)照藥材，保證處方中金銀花與菊花的投料， 同時(shí)， 在成分定量測(cè)定中， 加入菊花的 3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸指標(biāo)的測(cè)定， 可對(duì)菊花進(jìn)行定性鑒別。在桔梗的薄層色譜定性鑒別中，參考《中國(guó)藥典》采用酸溶液水解皂苷的方式提取， 與桔梗對(duì)照藥材對(duì)比，充分顯示出多個(gè)斑點(diǎn)的一致性，說明該提取方式對(duì)鑒別有效、可操作。

表 3 綠原酸、 木犀草苷、 哈巴俄苷、 3，5-0-二咖啡?；鼘幩釡y(cè)定結(jié)果 （n=3）Tab.3 Determ ination results of chlorogenic acid， cynaroside， harpagoside and 3，5-0-dicaffeoyl quinic acid（ n=3）

4.4 本實(shí)驗(yàn)對(duì)以消癭化結(jié)湯為處方基礎(chǔ)所開發(fā)的院內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑銀菊散結(jié)口服液，進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制研究。為保證處方的投料，采用了薄層色譜定性鑒別，利用高效液相色譜法兩個(gè)波長(zhǎng)通道梯度洗脫方式同時(shí)測(cè)定本品中金銀花與菊花中綠原酸、木犀草苷與菊花中 3，5-O-二咖啡?；鼘幩嵋约靶⒅泄投碥盏牧?，作為4種成分的定量分析，經(jīng)穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性和回收率試驗(yàn)，證明該方法所建立的檢測(cè)方法專屬、簡(jiǎn)便、可行，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可起到全面多維度控制制劑質(zhì)量的作用。

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Quality standard for Yinju Sanjie Oral Liquid

FU Qing-xia1， WANG Jian-cheng2， REN Ji-dong1
（1.Linyi People's Hospital， Linyi276003， China； 2.Linyi Institute for Drug and Food Control， Linyi 276001， China）

Yinju Sanjie Oral Liquid； chlorogenic acid； cynaroside； harpagoside； 3，5-O-dicaffeoyl quinic acid； TLC； HPLC

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）05-0986-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.022

2013-07-01

付慶霞 （1978—）， 女， 主管中藥師， 碩士， 從事中藥制劑與中藥質(zhì)量控制研究。 Tel： 13969991383