商慶華， 黃盼華， 吳文斌， 湯家銘*

（1.上?；惿镝t(yī)藥科技有限公司， 上海 201203； 2.上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心， 上海 201203）

小鼠淋巴瘤 tk 基因突變試驗檢測雄黃的致突變性

商慶華1， 黃盼華1， 吳文斌2， 湯家銘2*

（1.上?；惿镝t(yī)藥科技有限公司， 上海 201203； 2.上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心， 上海 201203）

目的 用小鼠淋巴瘤 tk基因突變試驗檢測雄黃浸出液的致突變性。 方法 在加或不加 S9 （萃巴比妥鈉 +β萘黃酮誘導鼠肝勻漿上清液） 條件下， 用不同質量濃度雄黃浸出液可溶性砷處理小鼠淋巴瘤 L5178Y細胞， 采用微孔板法進行細胞毒、平板接種效率和突變頻率測定，用統(tǒng)計學方法進行評價。結果 非活化條件下用雄黃浸出液處理3 h和24 h后， 隨著浸出液可溶性砷質量濃度的增加， 小鼠淋巴瘤細胞的平板效率 （PE0和 PE2）、 相對存活率 （RS0）、 相對懸浮生長 （RSG）、 相對總生長率 （RTG） 逐漸下降， 24 h 作用后最高劑量 3.0 μg/mL的 RS0僅為 6.72%、 RSG僅為 3.94%、 RTG僅為 0.34%， 表明雄黃對小鼠淋巴瘤細胞有明顯的毒性， 且作用時間長細胞毒性更明顯。 隨著浸出液可溶性砷質量濃度的上升， 抗性突變頻率 （MF） 呈現(xiàn)上升趨勢， 表明雄黃具有致突變性。 延長處理時間， 雄黃的致突變性增強。 活化條件下小鼠淋巴瘤細胞的 PE0、 PE2、 RS0、 RSG、 RTG和 MF的變化與非活化條件下結果相似，表明浸出液可溶性砷的毒性和致突變性不依賴于 S9 的活化。 結論 雄黃浸出液可溶性砷對小鼠淋巴瘤 L5178Y細胞具有致突變性。

小鼠淋巴瘤 L5178Y細胞； tk基因突變； 雄黃； 可溶性砷； 致突變

小鼠淋巴瘤細胞 tk基因突變試驗 （mouse lymphoma tk genemutation assay，MLA）是一種體外哺乳動物細胞遺傳毒性評價試驗方法，已被廣泛用于檢測藥物和化合物的遺傳毒性，被認為是最敏感的體外致突變試驗之 一［1-4］。該方法不但可檢 出點突變、染色體畸變和重組等，而且還可檢出非整倍體誘導劑等依賴于細胞周期的突變劑，因此早已被藥品注冊審批國際協(xié)調組織 （ICH） 推薦的標準實驗系列組成 部分［5］。 在 ICH最新版的 《指導原則》中， MLA被認為可以替代體外 CHL細胞染色體畸變試驗或體外微核試驗，與其他遺傳毒性試驗組合使用。特別是當受試物為抗生素時，抗生素的抑菌作用影響 Ames試驗的判斷，需要增加 MLA進行檢測［6］。

雄黃是一味常用的礦物類中藥，主含二硫化二砷，具有抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痙、止痛和殺蟲等功效， 在2010 年版的 《中華人民共和國藥典》 收錄的中成藥中有 24 種含雄黃，占全部中成藥的4.6%［7］。為了全 面 評 價雄 黃 的 遺 傳 毒 性， 采 用ICH和我國 《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》［8］推薦的多種遺傳毒性試驗方法進行了研究。現(xiàn)將其中用 MLA檢測雄黃的致突變性試驗結果報道如下。

1 材料

1.1 受 試 物 雄 黃 浸 出 液， 將 批 號 為H2007052401 的雄黃 （產自湖南石門雄黃礦業(yè)）1.0 g溶于10mL的平衡鹽溶液 （HBSS）中形成混懸液， 37 ℃水浴搖床以 100 r/min 水浴震蕩 4 h 后靜止20 h， 取上清液過濾后制成雄黃浸出液， 經上海市食品藥品檢驗所測定可溶性砷質量濃度為1.20 mg/mL，冷藏保存?zhèn)溆谩?陽性對照甲基磺酸甲 酯 （ MMS， sigma， 批 號 78697 ） 、 環(huán) 磷 酰 胺（CP， 江蘇恒瑞）， 選擇突變劑三氟胸苷 （TFT，sigma， 批號 T2255）

1.2 細胞 小鼠淋巴瘤 L5178Y tk+/-，購自中國科學研究院細胞庫。

1.3 培養(yǎng)基和試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基、 馬血清、雙抗 （GIBCO公 司）、 丙 酮 酸 鈉 （ sigma公 司），NaHCO3、胸腺嘧啶脫氧核苷、 次黃嘌呤、 甘氨酸（均為國藥集團化學試劑有限公司） 和甲氨喋呤（sigma公司） 組成的 THMG和 THG培養(yǎng)液。

1.4 代謝活化劑 S9 由苯巴比妥鈉與 β-萘黃酮聯(lián)合誘導大鼠，取肝勻漿后離心獲得上清，臨用前S9 與 180 mg/mL的 6-磷酸葡萄糖、 25 mg/m L的NADP、 150 mmol/L的 KCl以體積比 2 ∶1 ∶1 配制成 S9 混合液，S9 混合液終體積分數(shù)為 2%。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 取清除自發(fā)突變細胞后的對數(shù)生長期 細 胞， 以 2 ×105個/mL的 密 度 在 THMG（0.1 μg/mL甲氨喋呤、3 μg/mL胸腺嘧啶脫氧核苷、 5 μg/mL次黃嘌呤和 7.5 μg/mL甘氨酸） 培養(yǎng)液中培養(yǎng) 1 d， 條件為 37 ℃、 5%CO2、 飽和濕度。 1 000 r/min， 10 min 離心細胞， 棄去上清， 用RPMI 1640 培養(yǎng)基洗滌細胞， 轉入 THG （3 μg/mL胸 腺 嘧 啶 脫 氧 核 苷、5 μg/mL次 黃 嘌 呤 和7.5 μg/mL甘氨酸） 培養(yǎng)基中， 培養(yǎng) 2 d， 每日計數(shù)細胞， 并調整細胞密度為 2 ×105個/m L。

2.2 細胞的受試物暴露 取對數(shù)生長期的細胞調整密度為 5 ×105個/mL， 按 1%體積加入受試物使雄黃浸出液可溶性砷終質量濃 度為 0.75、 1.5、3.0、 6.0 μg/mL， 同時設立陰性對照組和陽性對照 組 （-S9：3 h， 10 μg/mL MMS， 24 h， 5 μg/mLMMS； +S9：3 μg/mL CP）， 37 ℃震搖處理3/24 h， 離心， 棄上清液， 用 RPMI1640 培養(yǎng)基洗滌細胞 2 遍， 重新懸浮細胞于含 10%馬血清的RPMI1640 培 養(yǎng) 液 中， 并 調 整 細 胞 密 度 為 2 × 105個/mL。

2.3 0 天平板接種效率 PE0測定 取適量細胞懸液， 作梯度稀釋至 8 個細胞 /mL， 接種 96 孔板（每孔加 200 μL， 即平均 1.6 個細胞/孔）， 每個劑量做2塊板， 陰性及陽性對照做 4 塊板， 37 ℃，5%CO2， 飽和濕度條件下培養(yǎng) 12 d， 計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)。

2.4 表達培養(yǎng) 將步驟 “2.2”項所得細胞懸液作2 d表達培養(yǎng)，每天計數(shù)細胞密度并保持密度在106個 /m L以下。 計算相對懸浮生長 （ Relative Suspension Growth， RSG） 。

2.5 第2 天平板接種效率 PE2測定 2 d 表達培養(yǎng)結束后， 取適量細胞懸液， 按步驟 “2.3”項作梯度稀釋并接種 96 孔板， 培養(yǎng) 12 d 后計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)。

2.6 TFT抗性突變頻率測定 2 d 表達培養(yǎng)結束后， 取適量細胞懸液， 調整細胞密度為 1 ×104個/m L， 加入 TFT（終質量濃度為 3 μg/m L）， 混勻， 接種 96 孔板 （每孔加 200 μL， 即平均 2 000個細胞/孔）， 96 孔板四周各孔加 200 μL PBS，每個劑量做2塊板，陰性及陽性對照做4塊板，于37 ℃， 5%CO2， 飽和濕度條件下培養(yǎng) 12 d， 計數(shù)有突變集落生長的孔數(shù)。 突變集落按大集落 （LC：直徑 ≥ 1/4 孔 徑， 密 度 低） 和小 集 落 （SC： 直徑 ＜1/4 孔徑，密度高） 分別計數(shù)， 極小集落可再繼續(xù)培養(yǎng)3 d后計數(shù)。

2.7 結果計算和統(tǒng)計學處理

2.7.1 平板效率 （ PE0和 PE2） PE={ ［ -ln（EW/TW）］ /1.6} ×100% 式中 EW 為無集落生長的孔數(shù)； TW為總孔數(shù)； 1.6 為每孔接種細胞數(shù)。2.7.2 相對存活率 （RS） RS= ［PE（處理） / PE（對照）］ ×100%

2.7.3 相對懸浮生長（RSG） RSG= （處理組表達期間細胞增殖倍數(shù)/對照組表達期間細胞增殖倍數(shù)） ×100%

2.7.4 相對總生長率（RTG）RTG=RSG×RS2×100%， 式中 RSG為相對懸浮生長， RS2為第二天的相對存活率。

2.7.5 TFT抗性突變頻率 （MF） MF（ ×10-6） =［ -ln（EW/TW）］ /2 000/PE2式中： EW 為無集落生長的孔數(shù)； TW 為總孔數(shù)； 2 000 為每孔接種細胞數(shù)。

2.7.6 統(tǒng)計學處理 用 IBM SPSSStatistics19 對突變頻率進行統(tǒng)計分析，受試物各劑量組與陰性對照比較， P＜0.05 為具有顯著意義，P＜0.01 為具有極顯著意義。

3 結果

3.1 非活化條件下用雄黃浸出液 3 h/24 h 處理小鼠淋巴瘤 L5178Y細胞結果 表 1、 表 2 顯示， 非活化條件下 用 雄黃浸出液 處 理3 h 和24 h后， 隨著浸出液可溶性砷質量濃度的增加，小鼠淋巴瘤細胞的 PE0、 PE2、 RS0、 RSG、 RTG逐 漸 下 降， 其 中3 h作用后浸出液可 溶 性砷質量濃度在 3.0 μg/mL以上時 PE0、 PE2均在 60%以下； 24 h 作用后雄黃浸出液可溶性砷質量濃度在 0.75 μg/mL以上時PE0、 PE2均 在 60%以 下。 24 h 作 用 后 最 高 劑 量3.0 μg/mL的 RS0僅為 6.72%、 RSG僅為 3.94%、RTG僅為 0.34%，表明雄黃對小鼠淋巴瘤細胞有明顯的毒性，且作用時間長細胞毒性更明顯。

表 1 -S9/3 h條件下 雄 黃浸出液 的 小鼠淋巴 瘤 tk 基因突 變 試驗Tab.1 M ouse lym phoma tk genemutation assay by using realgar extract under the condition of 3 h co-culture w ithout S9

表 2 -S9/24 h條 件 下雄黃浸 出 液的小鼠 淋 巴瘤 tk 基 因 突變試驗Tab.2 M ouse lym phom a tk genemutation assay by using realgar extract under the condition of 24 h co-cultu re w ithout S9

隨著浸出液可溶性砷質量濃度的上升，MF呈現(xiàn)上升趨勢，表明雄黃具有致突變性。用雄黃浸出液處理3 h 后， 可溶性砷質量濃度達到3 μg/mL以上時，各劑量組與陰性對照比較，差異有極顯著意義（P＜0.01）；處理 24 h 后，可溶性砷質 量濃度達到0.75 μg/mL以上時，各劑量組與陰性對照比較，差異有極顯著意義 （P＜0.01）， 說明延長處理時間，雄黃的致突變性增強。3.2 活化條件下用雄黃浸出液 3 h 處 理小鼠淋巴瘤 L5178Y細胞結果表3顯示， 在活化條件下用雄黃浸出液處理3 h后， 隨著浸出液可溶性砷質量濃度的增加，小鼠淋巴瘤細胞的 PE0、 PE2、 RS0、RSG、 RTG逐漸下降，與非活化條件下的結果相似，表明雄黃可溶性砷對小鼠淋巴瘤細胞的毒性不依賴于S9的活化。

表 3 +S9/3 h條件下 雄 黃浸出液 的 小鼠淋巴 瘤 tk 基因突 變 試驗Tab.3 M ouse lymphoma tk genemutation assay by using realgar extract under the condition of 3 h co-culture with S9

隨著浸出液可溶性砷質量濃度的上升， MF亦呈現(xiàn)上升趨勢，但與非活化條件下相比，同一劑量的MF并沒有明顯上升，說明雄黃的致突變性亦不依賴于S9的活化。

4 討論

MLA是用于檢測藥物或化合物致突變試驗方法， 被 ICH推薦為藥物遺傳毒性評價的哺乳動物細胞體外試驗之一［6］。 我國在食品、保健食品、藥品、化妝品等安全性評價領域也將此試驗列入推薦方法之一［9］。 特別是對一些抗生素類藥物或本身具有抗菌、抑菌作用的中藥、天然藥物進行致突變性評價時， Ames試驗所用的各鼠傷寒沙門氏菌株會受到受試物的抑制而無法獲得可靠的結果，此時應用MLA就具有獨特的優(yōu)勢。 本課題組在研究中藥雄黃的遺傳毒性， 用 Ames試驗時就發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象， 因而增加 MLA檢測方法， 從致突變性方面評價其遺傳毒性。

在先前的研究中已經證實雄黃的毒性存在于可溶性砷部分［10］， 因而可直接用雄黃浸出液作為供試品進行研究。

據文獻報道， MLA可采用短期處理 （3 h） 和長期處理 （24 h） 結合的方法， 以提高檢測的敏感性， 檢出短 期 處 理呈 陰 性 的某 些 化 學 物［11-13］。 本研究分別采用短期 （3 h） 和長期 （24 h） 處理、有或無代謝活化系統(tǒng) （S9） 處理評價雄黃的致突變性。

本次試驗中， 無論是有或無 S9， 3 h 或 24 h，小鼠淋巴瘤細胞的 PE0、 PE2、 RS0、 RSG、 RTG隨著可溶性砷的質量濃度升高而逐漸下降，最高質量濃度時這些指標均在 20%以下， 表明可溶性砷對細胞的毒性較大，這與此前的研究中發(fā)現(xiàn)可溶性砷對 CHL細胞毒性較大［14］相一致。

本試驗結果表明，隨著雄黃浸出液可溶性砷濃度增大， 小鼠淋巴瘤細胞 tk基因的突變頻率有升高的趨勢。

在非活化條件下3 h處理后，可溶性砷終質量濃度為 3.0 μg/mL以上時， 即對淋巴瘤細胞表現(xiàn)出明顯的誘變性，其 MF為陰性對照的4倍以上。24 h 處理后， 可溶性砷終質量濃度降 至 0.75 μg/mL以上時， 亦可對淋巴瘤細胞表現(xiàn)出明顯的誘變性， MF高于陰性對照 100 ×10-6以上； 當可溶性砷終質量濃度為 3.0 μg/mL以上時， 其 MF為陰性對照的6倍以上，表明可溶性砷與小鼠淋巴瘤細胞作用時間越長，其毒性就越大。

在活化條件下3 h處理后，可溶性砷終質量濃度為 1.5 μg/mL以上時， 即對淋巴瘤細胞表現(xiàn)出明顯的誘變性，其MF為陰性對照的2倍以上?？紤]到在活化條件下的MF與同劑量下非活化條件下的MF并沒有明顯增大，另外可溶性砷是無機物，在體內并不需要在肝臟代謝，因而認為可溶性砷的致突變性可能是藥物直接對細胞作用的結果。

在先前的研究中，用小鼠骨髓細胞微核試驗和彗星試驗、 CHL細胞染色體畸變試驗和倉鼠體內染色體畸變實驗均證實了雄黃具有較強的遺傳毒性［14-15］。 本次 實 驗結 果 表 明， 雄 黃 浸出 液 對 小 鼠淋巴瘤 L5178Y細胞也具有致突變性。

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Detection ofmutagenicity of realgar by mouse lym phoma tk genemutation assay

SHANG Qing-hua1， HUANG Pan-hua1， WUWen-bin2， TANG Jia-ming2*
（1.Shanghai Gene-cell Biotech Co.， Ltd.， Shanghai201203， China； 2.Laboratory Animal Center， Shanghai University of TCM， Shanghai201203，China）

mouse lymphoma L5178Y cell； tk genemutation； realgar； soluble arsenic； mutagenicity

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）05-0917-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.007

2013-04-17

科技部重大新藥創(chuàng)制基金 （2009ZX09502-002）

商慶華 （1985—） ， 女， 碩士， 主要從事細胞藥理研究。 E-mail： shangqinghuajisai@163.com

*通信作者： 湯家銘 （1952—） ， 男， 研究員， 主要從事中藥毒理方面研究。 E-mail： tangjiaming@hotmail.com