宋艷麗， 徐 坤， 韓騰飛， 李莎莎， 危紅華， 程 亮， 郝保華

（西北大學生命科學學院，陜西西安 710069）

甘草次酸固體脂質納米凝膠的制備及體外透皮效應

宋艷麗， 徐 坤， 韓騰飛， 李莎莎， 危紅華， 程 亮， 郝保華*

（西北大學生命科學學院，陜西西安 710069）

目的 制備甘草次酸固體脂質納米凝膠并考察其體外透皮效應。方法 采用微乳液法制備甘草次酸固體脂質納米粒并考察其包封率、粒徑與表面電位，以研和法制備固體脂質納米粒凝膠；采用改良Franz立式擴散池法進行體外透皮實驗，HPLC法測定甘草次酸，評價甘草次酸固體脂質納米粒凝膠的經(jīng)皮滲透結果。結果 甘草次酸固體脂質納米粒外觀為圓球形或橢球形；甘草次酸固體脂質納米粒的包封率為 （64.75±1.36）%，粒徑范圍（46.13±20.10）nm，電位分布范圍為 （－53.4±7.11）mV。24 h甘草次酸固體脂質納米粒凝膠較甘草次酸固體脂質納米粒的累積透過量提高66%。結論 甘草次酸固體脂質納米粒凝膠能提高甘草次酸的透皮速率，有望成為甘草次酸透皮給藥的新型制劑。

甘草次酸；固體脂質納米粒；凝膠；體外透皮

甘草次酸 （glycyrrhetinic acid，GA）是豆科植物甘草的主要活性成分［1］，主要從甘草的根部或根莖提取而得，屬五環(huán)三萜皂苷類化合物［2］。甘草次酸具有明顯的抗炎抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化與免疫調(diào)節(jié)等多方面的藥理活性［1］，臨床常用于治療濕疹、蕁麻疹、皮炎等皮膚病，但由于其為強的親脂性成分，制成普通制劑經(jīng)皮給藥其滲透率低［3］。凝膠經(jīng)皮給藥制劑可以避免肝臟的首關效應，從而提高藥物的生物利用度［4］。故本實驗將甘草次酸制備為經(jīng)皮給藥制劑固體脂質納米粒凝膠。

固體脂質納米粒［5］（solid lipid nanoparticles，SLNs）是采用可生物降解的載體材料制成的具有良好的緩控釋作用和靶向性的一種劑型；生產(chǎn)過程不添加有機溶劑，克服了產(chǎn)品中有機溶劑不能完全揮盡的缺點。固體脂質納米粒給藥系統(tǒng)主要用于水不溶性藥物［6］或者毒性大［7］的藥物，其中多數(shù)為抗腫瘤藥物［8-9］。

凝膠劑具有良好的生物相容性，對藥物釋放具有緩釋、控釋作用，且制備工藝簡單而外形美觀［10］，文獻報道凝膠作為給藥基質，有促進透皮速率和在皮膚中的滯留量的作用［11-13］。劉麗宏［14］等以凝膠為載體制備了氯麻鼻用凝膠，該制劑提高了藥物的生物利用度且延長了藥物的作用時間。因此，本實驗將甘草次酸制備為固體脂質納米粒凝膠劑，以其提高藥物的經(jīng)皮透過量，為甘草次酸新型制劑的開發(fā)研究提供實驗依據(jù)。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器 78-1型磁力加熱攪拌器 （江蘇省金壇市正基儀器有限公司）；AG－285電子天平 （德國METTLER公司）；AH-系列高壓均質機 （ATSEn-gineering Inc.）；ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀（英國Malvern公司）；島津LC-20AT高效液相色譜儀 （日本島津公司）；JEM-2000EX透射電子顯微鏡（日本電子公司）。

1.2 藥品和試劑 甘草次酸 （質量分數(shù)≥98%，西安小草植物科技有限責任公司）；大豆卵磷脂（天津市博迪化工有限公司）；單硬脂酸甘油酯（上海山浦化工有限公司）；吐溫－80（成都市科隆化工試劑廠）；卡波姆934P（美國譽謄公司）；甲醇（Sigma，色譜純）；其他試劑均為分析純；0.22 μm的微孔濾膜 （上海新亞藥業(yè)有限公司）。

1.3 動物 小鼠，雄性，清潔級 （合格證號：陜西動證2006105），購自西安交通大學醫(yī)學院。

2 甘草次酸固體脂質納米粒凝膠的制備

2.1 甘草次酸固體脂質納米粒的制備

2.1.1 空白固體脂質體納米粒的制備 采用微乳液法制備空白固體脂質納米粒，將處方量0.6 mL乳化劑吐溫－80置于燒杯中，加46.2 mL蒸餾水超聲分散至完全溶解，置于恒溫水浴中，得到水相。將處方量的脂質單硬脂酸甘油酯2.0 g與大豆磷脂1.0 g在恒溫磁力攪拌器上加熱融化，在磁力攪拌器攪拌下，水相以10 mL/min的體積流量加到油相中，繼續(xù)攪拌30 min，停止加熱，得初分散體系。將初分散體系在AH-系列高壓均質機上60 MPa乳勻6次，過0.22 μm濾膜，即得。

2.1.2 甘草次酸固體脂質納米粒的制備 采用微乳液法制備甘草次酸固體脂質納米粒，將處方量0.6 mL乳化劑吐溫－80置于燒杯中，加46.2 mL蒸餾水超聲分散至完全溶解，置于恒溫水浴中，得到水相。將處方量甘草次酸0.1 g與脂質單硬脂酸甘油酯2.0 g與大豆磷脂1.0 g在恒溫磁力攪拌器上加熱融化，在磁力攪拌器攪拌下，水相以10 mL/min的體積流量加到油相中，繼續(xù)攪拌30 min，停止加熱，得初分散體系。將初分散體系在AH-系列高壓均質機上60 MPa乳勻6次，過0.22 μm濾膜，即得甘草次酸固體脂質納米粒。

2.2 甘草次酸固體脂質納米粒理化考察

2.2.1 GA-SLNs外觀形態(tài) 取甘草次酸固體脂質納米粒浮懸液適量，用蒸餾水稀釋至一定倍數(shù)后，滴至專用銅網(wǎng)上，用20 g/L磷鎢酸復染，于透射電子顯微鏡下觀察樣品形態(tài)，結果見圖1。

甘草次酸–固體脂質納米粒透射電鏡照片顯示甘草次酸固體脂質納米粒呈球形或橢球形，粒子分布比較均勻且無相互黏連。

圖1 甘草次酸固體脂質納米粒的透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 TEM of GA-SLNs

2.2.2 GA-SLNs粒徑分布與表面電位 取甘草次酸-固體脂質納米?；鞈乙? mL用雙蒸水稀釋至30 mL，置于馬爾文ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀中，測量溫度25℃，分散介質水的折光率為1.333，黏度為0.887 2 cP，激光入射角度90°，波長635 nm，進行粒度測定，用Zeta電位測定專用比色皿進行Zeta電位測定，每個樣品進行3次測定，取平均值。粒徑分布見圖2。Zata電位分布見圖3。

圖2 甘草次酸-固體脂質納米粒的粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of GA-SLNs

圖3 甘草次酸-固體脂質納米粒的表面電位圖Fig.3 Particle surface potential of GA-SLNs

由圖2可知平均粒徑在57.19 nm，粒徑范圍（46.13±20.10）nm，粒徑分布較窄。

由圖3可知甘草次酸-固體脂質納米粒表面帶有負電位，大多數(shù)集中在－53.4 mV，電位分布范圍為 （－53.4±7.11）mV。當表面電荷的絕對值大于30 mV時，代表分散體系比較穩(wěn)定。2.2.3 包封率的測定 精密量取1 mL甘草次酸-固體脂質納米粒，上Sephadex-G50柱 （250 mm×16 mm），以水為洗脫液，加甲醇超聲破乳，定容，靜置，取上清液進樣。上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液采用“3.1”項下色譜條件測定，測得的峰面積帶入標準曲線計算藥物濃度。

包封率的計算公式為：EE%=C納米粒/C總藥量×100%。所制得甘草次酸固體脂質納米粒的平均包封率為64.75%。

2.3 甘草次酸固體脂質納米粒凝膠的制備

2.3.1 空白凝膠劑的制備 稱取0.2 g卡波姆，加水10 mL溶脹24 h，加入0.8 mL乙醇后再繼續(xù)滴加三乙醇胺至中性成凝膠，邊滴加邊攪拌，最后加水至20 mL，即得。前期做實驗時制備相同比例的卡波姆與乙醇多份，開始時均采用pH試紙測定，在pH大約為6時，記錄采用三乙醇胺的滴數(shù)，第一份加入一滴后，取出其中0.5 g，加入50 mL水，加熱至80℃，攪勻，放冷，用pH計測定，記錄 pH；第二份加入兩滴后，取出其中0.5 g，加入50 mL水，加熱至80℃，攪勻，放冷，用pH計測定，記錄pH；依此類推直到pH 7為止。采用此法進行pH控制。

2.3.2 甘草次酸凝膠劑的制備 稱取0.2 g卡波姆，加水10 mL溶脹24 h。稱取甘草次酸0.02 g，溶解在0.8 mL的乙醇中，藥物的乙醇溶液倒入溶脹后的卡波姆，滴加三乙醇胺至中性成凝膠，邊滴加邊攪拌，最后加水至20 mL，即得。

2.3.3 納米粒凝膠的制備 按照“2.3.1”項制備空白凝膠，與“2.1.2”項制備固體脂質納米粒1∶1混合，即得含藥0.1%的納米粒凝膠。

2.4 甘草次酸固體脂質納米粒質量控制

2.4.1 納米粒凝膠的性狀 本品為乳白色透明凝膠，稠度適宜，涂展性好，膠體均勻細膩。

2.4.2 納米粒凝膠的pH 取樣品10 g，加100 mL蒸餾水，攪勻，于pH計上依法測定，3批樣品的pH分別為7.07、7.23、7.37，符合相關規(guī)定。

3 甘草次酸的測定

圖4 甘草次酸的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of glycyrrhetinic acid

3.1 色譜條件［15］Shim-pack VP-ODS C18色譜柱（150 mm ×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-水-冰醋酸 （89∶10∶1）；體積流量為0.5 mL/min；檢測波長為250 nm，進樣量為20 μL，柱溫為30℃。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品貯備液的配制 精密稱定甘草次酸對照品10.0 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，得甘草次酸貯備液。

3.2.2 標準曲線的制備 精密吸取上述貯備液0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，分別置于20 mL量瓶中并用甲醇定容，得到對照品系列質量濃度 （C）的溶液。按“3.1”項下色譜條件分別進樣，記錄峰面積 （A）。以A對C進行回歸，回歸方程：A=52 312C－11 061.9（r=0.999 4），在1.0～80 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關系。

3.2.3 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液20 μL重復進樣5次，測定指標峰峰面積，RSD為1.95%，表明儀器精密度良好。

3.2.4 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、10、24 h進樣，測定甘草次酸色譜峰面積，RSD為1.38%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.5 方法專屬性考察 精密吸取用空白接受液浸泡過12 h的小鼠皮的陰性對照溶液1 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后按上述色譜條件進樣分析。由圖4可以看出鼠皮溶出物對甘草次酸測定無干擾。3.2.6 回收率試驗 分別向已知量的滲透液樣品中加入一定量甘草次酸對照品溶液，用流動相加至10 mL混勻后，精密吸取20 μL注入液相色譜儀，測定指標峰峰面積，利用標準曲線計算甘草次酸量，并計算加樣回收率。結果甘草次酸平均加樣回收率為95.69%，其RSD為0.89%。見表1。

表1 回收率試驗結果 （n=9）Tab.1 Results of recovery tests（n=9）

4 甘草次酸固體脂質納米粒凝膠體外經(jīng)皮滲透實驗

4.1 實驗皮膚的制備 取體質量合格的健康昆明種小鼠，脫頸處死，剝?nèi)「共科つw，剪去毛發(fā)及剔除皮下脂肪，用蒸餾水沖洗干凈，并用生理鹽水沖洗至無渾濁為止，備用 （皮膚用鋁箔包裹，置于低溫冰箱中保存，試驗時取出，室溫下自然解凍后使用）。

4.2 經(jīng)皮滲透實驗 取出處理好的小鼠皮膚置于Franz立式擴散池上 （有效擴散面積為3.14 cm2），將角質層朝向供給池，真皮層朝向接受液，將多余的皮膚剪去，固定裝置。在接收池中注入19.0 mL磷酸鹽緩沖液 （pH 7.3）為接收液，將接收池置于磁力攪拌器上，350 r/min攪拌。另取一套Franz擴散池裝置，同法操作，將不含藥物的固體脂質納米粒凝膠空白基質緊貼于離體鼠皮角質層一側，作為空白對照。分別于規(guī)定的時間點0.5、2、4、6、8、12、24 h取樣0.5 mL，并及時補充等量新鮮接收液。提取液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，取20 μL注入高效液相色譜儀，測定峰面積，代入標準曲線求出藥物質量濃度，計算累積滲透藥量。每組平行操作3次，平均累計滲透量見圖5。小鼠皮膚經(jīng)過24 h透皮給藥試驗后，取下后肉眼觀看到皮膚表面的紋理較之前清晰可見，再于顯微鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)破損現(xiàn)象。

根據(jù)每個取樣點樣品的質量濃度，依下式計算皮膚單位面積累積滲透量Q：

式中Q為累積滲透量；Cn和Ci分別為第n、i個取樣點測得的藥物質量濃度 （g/mL），V和V0分別為接收池體積和取樣體積 （mL），A為滲透面積（cm2）。

圖5 甘草次酸3種劑型透皮累積量 （n=3，±s）Fig.5 Accumulated permeation amount of three glycyrrhetinic acid formulations（n=3，±s）

由圖可知甘草次酸固體脂質納米粒凝膠24 h累計透過量為1 278.4 μg/（cm2·h），甘草次酸水凝膠24 h累計透過量為830.7 μg/（cm2·h），甘草次酸固體脂質納米粒24 h的累積透過量為931.5 μg/（cm2·h）；甘草次酸固體脂質納米粒凝膠24 h累計透過量較甘草次酸水凝膠提高了30%，較甘草次酸固體脂質納米粒提高了66%。

5 討論

固體脂質納米粒的制備方法有溶劑擴散法、微乳法、高壓乳勻法、溶劑乳化揮發(fā)法、薄膜-超聲分散法［16］。本實驗采用微乳液法制備甘草次酸固體脂質納米甘草次酸固體脂質納米粒。在制備過程中，磷脂的用量對固體脂質納米粒的穩(wěn)定性和粒徑均有很大的影響，當磷脂用量超過1.0 g時容易產(chǎn)生沉淀而分層且粒徑會增大；脂質材料在乳化時乳化的溫度應控制在60～80℃之間，在這個范圍內(nèi)溫度越高納米粒的粒徑越小，當溫度過高時會引起磷脂或是某些藥物的降解，甚至造成混懸液的黏度過大不易洗脫，從而影響制備的固體脂質納米粒的質量和載藥量。高壓乳化的壓力和循環(huán)次數(shù)對粒徑也有比較大的影響，粒徑會隨壓力增大而變小，在60 MPa壓力下，循環(huán)6次后粒徑基本不隨循環(huán)次數(shù)增加而減小。

由透皮實驗的結果可知24 h內(nèi)甘草次酸固體脂質納米粒凝膠的總累積透過量相對于甘草次酸固體脂質納米粒提高了66%，相對于甘草次酸gel總透皮累積量提高了30%。本實驗表明，甘草次酸固體脂質納米粒凝膠與凝膠相比，不僅能增加甘草次酸的透皮速率，提高了藥物的生物利用度，甘草次酸固體脂質納米粒凝膠制劑有希望成為甘草次酸透皮給藥的新型制劑。

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Preparation and transdermal delivery of glycyrrhetinic acid loaded solid lipid nanoparticles gel

SONG Yan-li， XU Kun， HAN Teng-fei， LI Sha-sha， WEI Hong-hua， CHENG Liang，HAO Bao-hua*

（College of Life Science，Northwest University，Xi’an 710069，China）

glycyrrhetinic acid；solid lipid nanoparticles；gel；transdermal delivery

R944

A

1001-1528（2014）05-0952-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.015

2013-04-12

國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項 （2009ZX09502-019）

宋艷麗 （1986—），女，碩士生，研究方向：中藥經(jīng)皮給藥。Tel：18192323192，Email：songyanli0402@sina.com

*通信作者：郝保華，男，教授，研究方向：中醫(yī)基礎理論和中藥新劑型給藥系統(tǒng)。Email：haobaohua@126.com