任其龍， 董新艷， 鮑宗必

(1.浙江大學化學工程與生物工程學系生物質(zhì)化工教育部重點實驗室，浙江杭州310027;2.浙江大學寧波理工學院生物與化學工程分院，浙江寧波315100)

1 循環(huán)高效液相色譜技術(shù)分離純化復(fù)雜生物源的復(fù)合糖

當前，糖生物學領(lǐng)域亟須建立糖標準品庫，盡管許多低聚糖已能通過化學合成方法獲得，但一些具有重要生理活性的復(fù)合糖仍難以合成制備。為解決這一問題，美國印第安納大學伯明頓分校的Novotny等［1］采用循環(huán)高效液相色譜技術(shù)從多種天然產(chǎn)物中分離純化復(fù)合糖。循環(huán)高效液相色譜由2根色譜短柱和1個十通閥組成，十通閥將待分離組分交替循環(huán)輸入2根色譜柱進行循環(huán)分離，通過連續(xù)的循環(huán)操作方式實現(xiàn)模擬長柱的色譜分離效果，獲得了比傳統(tǒng)長色譜柱更高的分離效率。在此之前該方法尚未用于復(fù)雜生物活性物質(zhì)的分離。他們應(yīng)用此方法通過親水性色譜柱Amide-80有效分離了海藻低聚糖混合物以及糖蛋白中N-聚糖混合物，并得到純度＞98%的低聚糖及聚糖同分異構(gòu)體，如棉子糖和松三糖、3種高甘露糖型聚糖異構(gòu)體。

2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測法定量分析低聚糖

因缺少標樣，不同構(gòu)型的低聚糖常難以做定量分析。雖然三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)(multiple reaction monitoring，MRM)常用于定量分析復(fù)雜混合物中低含量物質(zhì)，但四極桿質(zhì)譜的質(zhì)量檢測范圍有限，因此MRM很少用于定量分析復(fù)雜易變的大分子低聚糖(Mr=5000 Da)等生物分子。美國加州大學的Lebrilla等［2］報道了一種應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜MRM法定量分析低聚糖的方法。通過對離子源源內(nèi)條件的優(yōu)化來提高低聚糖二級質(zhì)譜母離子的豐度，同時通過對母離子的源內(nèi)碰撞誘導解離技術(shù)研究選擇最佳的特征碎片離子對，以得到最佳靈敏度。實驗時需選擇至少兩個離子對用于定量和定性分析，這些離子對對應(yīng)單電荷的單糖、雙糖和三糖離子。該方法的檢出限在fmol水平，定量范圍跨越5個數(shù)量級。僅采用7種低聚糖標樣即可用于測定人乳中所有種類的低聚糖，根據(jù)響應(yīng)因子來計算不同結(jié)構(gòu)低聚糖的絕對量和總低聚糖量。

3 在線加氫反應(yīng)結(jié)合二維氣相色譜分離脂肪酸甲酯

動植物油脂中的脂肪酸包括飽和、單不飽和及多不飽和脂肪酸，且相同不飽和度的不飽和脂肪酸又有多種同分異構(gòu)體，成分非常復(fù)雜。脂肪酸的單體分離分析具有很大的難度。美國馬里蘭大學帕克分校的Delmonte等［3］報道了一種二維氣相色譜分離脂肪酸甲酯的新方法。他們采用兩個長短不同的強極性離子液體毛細管柱SLB-IL111分離脂肪酸甲酯，該色譜柱對具有不同雙鍵數(shù)及不同雙鍵位置、構(gòu)型的脂肪酸甲酯具有較高的分離選擇性。此外，將涂覆鈀的毛細管置于上述二維色譜之間，以氫氣為載氣，不飽和脂肪酸在毛細管內(nèi)經(jīng)加氫還原生成飽和脂肪酸，還原產(chǎn)物再進入第二維色譜柱進行分離。該方法與常規(guī)的二維氣相色譜不同，并不是通過改變兩柱溫度和極性來實現(xiàn)分離，而是在二維色譜間引入化學反應(yīng)來改變待分析物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，從而增強脂肪酸甲酯的分離效果。因此選擇兩個相同的色譜柱便可對復(fù)雜混合樣品(如脂肪酸甲酯混合標準品、鯡魚油中脂肪酸甲酯等)進行色譜分離。

4 不飽和脂肪酸碳碳雙鍵位置的確定

不飽和脂肪酸具有多種雙鍵位置異構(gòu)體和構(gòu)型異構(gòu)體，且不飽和脂肪酸的生物活性及物理化學性質(zhì)主要取決于其碳碳雙鍵的位置及數(shù)目，因此對不同雙鍵位置異構(gòu)及構(gòu)型異構(gòu)體結(jié)構(gòu)的準確鑒定具有重要的意義。質(zhì)譜法因高靈敏性和選擇性且能提供詳細的結(jié)構(gòu)信息而成為不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)鑒定的最有效方法之一。然而，由于低能碰撞誘導解離過程產(chǎn)生的碎片離子通常不能明確雙鍵位置，因此僅靠傳統(tǒng)的串聯(lián)質(zhì)譜法難以有效確定脂肪酸的雙鍵位置。有效的解決方法是在質(zhì)譜分析前，通過化學衍生化方法對碳碳雙鍵進行標記，并通過衍生物的質(zhì)譜圖來鑒定雙鍵位置。以下是兩個實例。

(1)銀離子色譜/在線臭氧氧化反應(yīng)/質(zhì)譜聯(lián)用鑒定共軛亞油酸異構(gòu)體 加拿大阿爾伯塔大學的Curtis課題組［4］采用一種新穎的銀離子色譜/在線臭氧氧化反應(yīng)/質(zhì)譜(Ag+-LC/O3-MS)方法鑒定共軛亞油酸異構(gòu)體。從銀離子色譜柱流出的含共軛亞油酸異構(gòu)體的流動相進入一個富含臭氧的滲透性微孔反應(yīng)管，其中的臭氧由管壁外滲入管內(nèi)，將共軛亞油酸中的碳碳雙鍵氧化斷裂生成醛。該臭氧氧化產(chǎn)物直接進入大氣壓光電離源(APPI)進行質(zhì)譜分析，通過分析醛及相應(yīng)丟失的甲醇碎片離子可直接確定雙鍵位置。這種在線臭氧反應(yīng)器可以直接連接HPLC和MS，對分析復(fù)雜脂類混合物提供多維信息。采用該方法不僅能通過質(zhì)譜圖確定共軛亞油酸位置異構(gòu)體，而且還能通過銀離子色譜的洗脫順序確定共軛亞油酸雙鍵構(gòu)型異構(gòu)體。他們用這一方法快速直接地確定了復(fù)雜脂肪酸混合物如牛奶脂肪、乳酸菌脂肪中的共軛亞油酸異構(gòu)體。

(2)利用Paternò-Büchi反應(yīng)耦合質(zhì)譜鑒定脂肪酸中雙鍵位置 美國普渡大學的Xia教授等［5］報道了一種通過Paternò-Büchi反應(yīng)結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜鑒定不飽和脂肪酸碳碳雙鍵位置的新方法。Paternò-Büchi反應(yīng)是在紫外激發(fā)下，將醛或酮的羰基活化生成自由基，再進一步和脂肪酸碳碳雙鍵反應(yīng)生成氧雜環(huán)丁烷。采用三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀檢測，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)碰撞活化促進逆向Paternò-Büchi反應(yīng)，生成新的烯和酮，并產(chǎn)生能反映母體分子的碎片離子，從而確定不飽和脂肪酸的碳碳雙鍵位置。他們應(yīng)用此方法有效鑒定了油酸、亞油酸、卵磷脂混合物、釀酒酵母中脂肪酸中的雙鍵位置。該方法可靈敏分析fmol量級的脂肪酸及復(fù)雜脂類混合物。此方法無需對質(zhì)譜儀進行調(diào)整，常規(guī)實驗設(shè)備即可滿足在線Paternò-Büchi反應(yīng)。不足的是，副反應(yīng)的存在使得復(fù)雜脂類混合物的質(zhì)譜圖非常復(fù)雜，降低了檢測的靈敏度，增加了結(jié)構(gòu)分析的難度。將在線Paternò-Büchi反應(yīng)和色譜分離相結(jié)合或許可解決這一問題。

［1］ Alley W R，Mann B F，Hruska V，et al.Anal Chem，2013，85:10408

［2］ Hong Q，Ruhaak L R，Totten S M，et al.Anal Chem，2014，86:2640

［3］ Delmonte P，F(xiàn)ardin-Kia A R，Rader J I.Anal Chem，2013，85:1517

［4］ Sun C，Black B A，Zhao Y Y，et al.Anal Chem，2013，85:7345

［5］ Ma X，Xia Y.Angew Chem Int Ed，2014，53:2592