錢飛中， 朱麗波， 徐能斌， 馮加永*， 洪正昉，徐立紅， 陳鐘佺， 汪晟樂

(1.寧波市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，浙江寧波315012;2.浙江省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，浙江杭州310012;3.紹興市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，浙江紹興312000)

2，4，6-三硝基苯酚又名苦味酸，是早期炸藥的主要成分，第二次世界大戰(zhàn)期間生產(chǎn)的苦味酸炸彈近些年仍然在德國(guó)、中國(guó)等地時(shí)有發(fā)現(xiàn)［1］。同時(shí)苦味酸廣泛用作染料、醫(yī)療中的收斂劑和殺菌劑等，也是許多芳香族硝基化合物生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物［2］?？辔端峋哂袕?qiáng)氧化性和強(qiáng)酸性，在環(huán)境中很快降解成毒性更大的苦氨酸等降解產(chǎn)物［3］。

苦味酸是我國(guó)地表水常規(guī)監(jiān)測(cè)化合物，目前的國(guó)標(biāo)方法采用衍生化-氣相色譜法檢測(cè)水體中的苦味酸［4］。該方法首先需要將沸點(diǎn)較高(300℃)的苦味酸衍生成沸點(diǎn)較低(112℃)的氯化苦，采用氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器(ECD)進(jìn)行檢測(cè)。該方法存在3個(gè)比較大的缺陷，一是需要用毒性較大的苯進(jìn)行萃取;二是用于反應(yīng)的次氯酸鈉不穩(wěn)定，衍生反應(yīng)難以控制，且氯化苦是一種極易爆炸的物質(zhì)，具有一定的危險(xiǎn)性;三是采用 ECD難以對(duì)目標(biāo)物準(zhǔn)確定性。

由于苦味酸是一種強(qiáng)酸和強(qiáng)極性化合物，其在25℃時(shí)電離常數(shù)達(dá)0.42，在水中能夠較為充分的電離，以至于在普通反相色譜柱中難以實(shí)現(xiàn)有效保留［5］。為了盡可能地使其在反相色譜柱中保留，需要在初始流動(dòng)相中使用很高比例的水相，以降低洗脫能力，使得方法的靈敏度較低［6］。在以往的文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)于苦味酸的保留通常有兩種方式［7］:一種采取離子抑制的方法，即在流動(dòng)相中添加酸性緩沖鹽以抑制苦味酸的電離，如Nipper等［8］使用組成為35%(v/v)甲醇和65%(v/v)醋酸鈉(pH為4.8)的流動(dòng)相分析苦味酸;另一種方法是使用離子對(duì)試劑，通過離子對(duì)試劑與待測(cè)離子結(jié)合增加其疏水性，從而增加待測(cè)離子在反相色譜柱中的保留，如Yost等［9］使用組成為50%(v/v)乙腈和50%(v/v)0.05 mol/L辛烷磺酰的流動(dòng)相，且流動(dòng)相中含有0.1 mol/L的三丁基氫氧化銨(tributyl ammonium hydroxide，TBAH)離子對(duì)試劑。通常使用的離子對(duì)試劑TBAH并不適合液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析，因?yàn)椴粨]發(fā)的離子對(duì)試劑會(huì)在LC-MS接口處沉淀而污染離子源。所以在Pamme等［7］的實(shí)驗(yàn)中使用了三丁基甲酸銨(tributyl ammonium formate，TBAF)這種揮發(fā)性的離子對(duì)試劑。但是，離子對(duì)試劑的使用一方面需要考慮其是否能夠完全反應(yīng)，另一方面如果離子對(duì)在進(jìn)樣口處不能及時(shí)完全揮發(fā)仍然可能導(dǎo)致儀器的污染。以上所述的液相方法及衍生化LC-MS方法中，由于儀器靈敏度只能達(dá)到mg/L 級(jí)［7－9］，因此必須采取高倍濃縮、凈化等方式進(jìn)行樣品前處理，需要時(shí)間較長(zhǎng)，過程復(fù)雜。

親水作用色譜主要針對(duì)在普通反相色譜中保留弱或者不保留的極性物質(zhì)，并且可以緩解在反相液相色譜中流動(dòng)相中高水相引起的反壓高及質(zhì)譜信號(hào)低等問題［10］。本文建立了超高效親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水中苦味酸及其降解產(chǎn)物苦氨酸的方法，實(shí)現(xiàn)了待測(cè)物的有效保留。本方法無需衍生，選擇性好，靈敏度高，分析速度快。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)，Quattro Premier XE三重四極桿質(zhì)譜儀(Waters公司);VisiprepTMSPE真空固相萃取裝置(Supelco公司);Oasis MAX固相萃取小柱(200 mg/6 mL，Waters公司);BEH HILIC色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司)。1.0 mL一次性無菌注射器(浙江玉升醫(yī)療器械有限公司);有機(jī)相針式濾器(13 mm×0.2 μm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。

苦氨酸、苦味酸(99.5%，AccuStandard公司);甲醇、乙腈、甲酸(HPLC級(jí)，TEDIA公司);醋酸、氨水(優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán));實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 樣品采集及前處理

地表水樣品12個(gè)，采自浙江省寧波市亭下水庫(kù)、晈口水庫(kù)、橫山水庫(kù)和白溪水庫(kù)。廢水樣品7個(gè)，采自浙江省杭州市蕭山區(qū)某采礦場(chǎng)周圍水域。

水樣使用100 mL棕色玻璃瓶采集，于4℃冷藏運(yùn)輸、保存，6 h內(nèi)檢測(cè)。地表水樣品使用一次性無菌注射器吸入約1.0 mL，經(jīng)過0.2 μm有機(jī)相針式濾器過濾后注入液相色譜進(jìn)樣小瓶中待測(cè)。廢水樣品采用固相萃取凈化，具體流程如下:用3 mL甲醇和3 mL水活化固相萃取小柱;將10 mL廢水樣品通過小柱，用5 mL 5%氨水淋洗小柱，棄去流出液;用10 mL含2%(v/v)甲酸的甲醇溶液將目標(biāo)物從小柱中洗脫出來，收集洗脫液，取1 mL待測(cè)。

1.3 色譜條件

柱溫40℃;流速0.25 mL/min;進(jìn)樣量5.0 μL;分離時(shí)間 3 min。流動(dòng)相:乙腈-水(90∶10，v/v)?？辔端帷⒖喟彼岬谋Ａ魰r(shí)間分別為0.86和1.13 min?？辔端岷涂喟彼峄旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

1.4 質(zhì)譜條件

三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);電噴霧電離(ESI)正離子電離模式;毛細(xì)管電壓3.0 kV;離子源溫度100℃;脫溶劑氣溫度200℃;脫溶劑氣流量450 L/h;錐孔氣流量50 L/h，各目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

圖1 苦味酸和苦氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的HILIC色譜圖Fig.1 HILIC chromatogram of picric acid and picramic acid

表1 苦味酸、苦氨酸的LC-MS參數(shù)Table 1 LC-MS parameters of picric acid and picramic acid

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

親水色譜柱是近年來發(fā)展起來的針對(duì)強(qiáng)極性化合物的新型液相色譜柱。本文對(duì)比了反相C18色譜柱(Acquity UPLC BEH C18 column，100 mm ×2.1 mm，1.7 μm)和親水作用色譜柱(Acquity UPLC BEH HILIC column，100 mm ×2.1 mm，1.7 μm)對(duì)苦味酸的保留，結(jié)果見圖2。

圖2 不同色譜柱分析苦味酸的UPLC-MS/MS色譜圖Fig.2 UPLC-MS/MS chromatograms of picric acid with different columns

從圖2可以看出，在HILIC色譜柱中，采用乙腈/水體系分析苦味酸，不僅實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)極性化合物的保留，而且靈敏度極高，峰形良好，無須使用緩沖鹽;在同樣的等度流動(dòng)相情況下，苦味酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在C18色譜柱中出現(xiàn)一個(gè)很寬的延展峰，無法實(shí)現(xiàn)有效保留。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化是通過在流動(dòng)注射模式下對(duì)1.0 mg/L的兩種物質(zhì)單獨(dú)進(jìn)樣完成的。首先比較了ESI和大氣壓化學(xué)電離(APCI)兩種電離源。在SIM模式下，ESI中兩種化合物的靈敏度明顯高于APCI，這與ESI更適用于極性物質(zhì)的結(jié)論相符［11］。在MRM模式中，苦味酸和苦氨酸最主要的子離子都是m/z 181.7，對(duì)于苦味酸是［M －H －NO2］－，對(duì)于苦氨酸是［M －OH］－，二級(jí)質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 苦味酸和苦氨酸的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectra of picric acid and picramic acid

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

在對(duì)廢水樣品進(jìn)行處理時(shí)，選取了適合強(qiáng)酸性物質(zhì)的Oasis MAX固相萃取小柱進(jìn)行萃取。由于本方法的檢測(cè)靈敏度足夠高，本研究未進(jìn)行復(fù)雜的樣品濃縮富集，簡(jiǎn)化了樣品前處理流程，既縮短了檢測(cè)時(shí)間，又提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度。在低、中、高3種濃度水平下同時(shí)添加兩種化合物標(biāo)準(zhǔn)品(加標(biāo)質(zhì)量濃度為 1.0、10.0、100.0 μg/L)，在地表水樣品中的回收率為89%～107%，在廢水樣品中的回收率為72%～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過20%。

2.4 方法驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)室空白和方法空白均未檢出目標(biāo)化合物。以2.0、20.0、100.0 μg/L空白加標(biāo)溶液做6次平行試驗(yàn)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%～14.7%。以空白實(shí)際水樣為基質(zhì)，添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過低濃度曲線外推法確定檢出限(三倍信噪比)，苦味酸和苦氨酸的檢出限分別為0.1和0.3 μg/L，滿足國(guó)家地表水標(biāo)準(zhǔn)限值要求［12］。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

在15個(gè)地表水樣品中均未檢出苦味酸和苦氨酸，在6個(gè)采礦場(chǎng)周圍水域樣品中苦味酸檢測(cè)結(jié)果為未檢出～59.5 μg/L;苦氨酸檢測(cè)結(jié)果為未檢出～12.3 μg/L。

3 結(jié)論

本研究采用HILIC色譜柱實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)極性物質(zhì)苦味酸在液相色譜中的有效保留。地表水樣品直接進(jìn)樣即可檢測(cè)，廢水樣品也只需通過SPE凈化而無需濃縮。串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)苦味酸和苦氨酸定性準(zhǔn)確。本方法操作簡(jiǎn)便，選擇性好，靈敏度高，分析速度快，適用于地表水、生活污水、工業(yè)廢水等多種實(shí)際水樣的檢測(cè)。

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