高洋洋， 張朝暉， 劉 鑫， 盧曉宇， 嚴(yán) 華，何 悅， 楊大進(jìn)， 云 環(huán)*

(1.北京出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，北京100026;2.國家食品安全風(fēng)險評估中心，北京100021)

磺胺增效劑是指含有5-取代芐基-2，4-二氨基嘧啶的一類化合物，包括三甲氧芐氨嘧啶(trimethoprim，TMP)、二甲氧芐胺嘧啶(diaveridine，DVD)和二甲氧甲基芐胺嘧啶(ormetoprin，OMP)等(結(jié)構(gòu)見圖1)，為廣譜抑制劑，多與磺胺合用使細(xì)菌的葉酸代謝受到雙重阻斷，抗菌作用可增效數(shù)十倍?；前吩鲂┏Ｓ糜谛笄蒺B(yǎng)殖業(yè)中治療大腸桿菌引起的敗血癥、雞白痢及球蟲病等［1］。由于其在動物體內(nèi)代謝緩慢，殘留在肌肉組織及器官中的時間較長，并可通過食物鏈傳遞，人食用后會產(chǎn)生毒副作用及抗藥性。各國對磺胺增效劑都有嚴(yán)格的控制法規(guī):日本肯定列表對魚類中磺胺增效劑限量要求為50 ～100 μg/kg［2］;歐盟 1181/2002/EC 中也明確規(guī)定其不可用于產(chǎn)蛋類禽養(yǎng)殖業(yè)［3］;我國農(nóng)業(yè)部對磺胺增效劑的使用也明確規(guī)定三甲氧芐氨嘧啶限量不得超過 50 μg/kg［4］。

圖1 三甲氧芐氨嘧啶(TMP)、二甲氧芐氨嘧啶(DVD)、二甲氧甲基芐氨嘧啶(OMP)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of TMP，DVD and OMP TMP:trimethoprim;DVD:diaveridine;OMP:ormetoprin.

測定磺胺增效劑的方法主要有熒光分光光度法［5］、示差分光光度法［6］、膠體金免疫層析法［7］、液相色譜法［8－11］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［12－14］等。熒光分光光度法的選擇性較差，示差分光光度法易受干擾物的影響，膠體金免疫層析法的重復(fù)性較差，液相色譜法的靈敏度較低且無法提供結(jié)構(gòu)信息。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可提供待測物的結(jié)構(gòu)信息，具有較高的靈敏度和選擇性，是同時測定上述3種組分的理想方法。動物源性食品種類多、范圍廣，但有關(guān)磺胺增效劑檢測的報道所涉及的基質(zhì)種類較少，多集中在肉類產(chǎn)品［15］，乳制品僅有少量文獻(xiàn)［16－18］報道，對復(fù)雜基質(zhì)中磺胺增效劑的測定需要單獨(dú)建立前處理方法。本實(shí)驗不僅針對肉類和乳制品，還針對含有大量蛋白質(zhì)、脂肪及核黃素的雞肝和含有特殊磷脂質(zhì)的雞蛋提供了一種統(tǒng)一的、有效的前處理方法，和現(xiàn)有文獻(xiàn)方法相比，適用性更為廣泛且簡便快速，極大地節(jié)省了檢測時間和檢測成本。

本文針對雞肉、魚肉、雞肝、雞蛋、牛奶等多種基質(zhì)采用甲酸-乙腈作提取溶液，正己烷一步除脂，BEH C18柱色譜分離后經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定，建立了磺胺增效劑的準(zhǔn)確定性、定量檢測方法，具有高靈敏度和可靠性，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC-Xevo TQ MS型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);微孔濾膜(0.2 μm，美國Pall公司);超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司);小型高速離心機(jī)(德國Sigma公司);Aspecxl多通道固相萃取儀(法國Gilson公司);PCX固相萃取小柱(3 mL，美國菲羅門公司)。

三甲氧芐氨嘧啶(純度98.7%)、二甲氧芐氨嘧啶(純度99%)、二甲氧甲基芐氨嘧啶(純度99%)標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.Ehrenstorfer公司)。三氯乙酸、氨水(色譜純，美國TEDIA公司);乙腈、甲醇、甲酸、正己烷、醋酸銨(色譜純，美國Fisher公司);二氯甲烷(分析級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗用水均由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇分別配制質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃下避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液:取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于4℃下避光保存。

1.3 UPLC-MS/MS 條件

1.3.1 UPLC 條件

色譜柱:Acquity UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm;美國 Waters公司)。流動相 A為甲醇，流動相B為5 mmol/L醋酸銨(含0.1%(v/v)甲酸)。梯度洗脫程序:0～1.0 min，10%A～20%A;1.0～2.0 min，20%A ～70%A;2.0～3.5 min，70%A～80%A;3.5～4.2 min，80%A ～10%A。流速:0.25 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣體積:10.0 μL。

1.3.2 MS/MS 條件

電噴霧離子源，正離子(ESI+)模式;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);電噴霧電壓:3.6 kV;霧化氣溫度:400℃;監(jiān)測離子對、錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 3種磺胺增效劑的多反應(yīng)監(jiān)測模式的串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters in multiple reaction monitoring(MR M)mode for the three sulfonamide potentiators

1.4 樣品提取和凈化

1.4.1 基質(zhì)分散法(適用于雞肉、魚肉、蛋、雞肝、脫脂牛奶，稀釋倍數(shù)為2.5)

準(zhǔn)確稱取2 g(精確到0.01 g)均勻樣品于干凈的50 mL塑料離心管中，加入5 g無水硫酸鈉，混勻后加入10 mL甲酸-乙腈(1∶9，v/v)提取液，渦漩混勻，超聲提取20 min，離心10 min(8 000 r/min)，取上清液2 mL置于10 mL離心管中待凈化。

取待凈化溶液，于35℃下濃縮至干。加入1.00 mL水溶解殘渣，加入3 mL正己烷渦漩混勻2 min，于5 000 r/min下離心3 min，將下層液過0.2 μm濾膜，濾液供UPLC-MS/MS分析。

1.4.2 固相萃取法(適用于全脂牛奶等含乳量高的樣品，稀釋倍數(shù)為1)

準(zhǔn)確稱取2 g(精確至0.01 g)均勻樣品于干凈的50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈，渦漩混勻，超聲提取20 min，離心10 min(8 000 r/min)，取上清液5 mL到10 mL離心管中待凈化。

將待凈化溶液移入PCX固相萃取柱(使用前用3 mL水和3 mL甲醇活化)，用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，用3 mL氨水-甲醇(1∶19，v/v)洗脫，于35℃下濃縮至干。加入1.00 mL水溶解殘渣，過0.2 μm濾膜，濾液供UPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取方法的優(yōu)化

本實(shí)驗以雞肉、魚肉、雞肝、雞蛋、牛奶樣品的加標(biāo)回收試驗(加標(biāo)水平為10 μg/kg，平行測定3份)考察了乙腈、甲酸-乙腈(1∶9，v/v)、三氯乙酸-乙腈(7∶3，v/v)3種提取溶液對三甲氧芐胺嘧啶的提取效率，發(fā)現(xiàn)甲酸-乙腈(1∶9，v/v)可獲得較高的提取效率(見表2)。這是由于磺胺增效劑結(jié)構(gòu)中含有多個氨基，呈強(qiáng)極性，難溶于非極性溶劑，易溶于極性有機(jī)溶劑，同時充分利用了乙腈能使蛋白質(zhì)變性沉淀的作用，簡化了實(shí)驗過程，而甲酸可使磺胺增效劑在酸性條件下更易形成正離子。

另外，采用基質(zhì)分散法提取樣品時加入適量的無水硫酸鈉不僅可以防止樣品結(jié)塊，同時還可以吸收樣品中的水分及干擾成分以免影響提取效率。

表2 不同提取液對雞肉、魚肉、雞肝、雞蛋和牛奶樣品中三甲氧芐胺嘧啶的提取回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 2 R ecoveries and relative standard deviations of trimethoprim in chicken muscle，fish muscle，chicken liver，egg and milk matrices with different extraction solvents(n=3)

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化

實(shí)驗初期嘗試以二氯甲烷為除脂溶劑，發(fā)現(xiàn)二氯甲烷除脂后的回收率僅為19.68%～32.00%，這是由于二氯甲烷在除脂的同時也溶解了一部分目標(biāo)分析物;改用正己烷除脂，回收率可達(dá)到90.65%～105.05%。

由于雞肉、魚肉、雞肝和雞蛋基質(zhì)內(nèi)含有的脂肪較高，本文分別嘗試了用正己烷2 mL一次除脂、2 mL二次重復(fù)除脂和3 mL一次除脂。實(shí)驗結(jié)果顯示:用3 mL正己烷一次除脂最為理想;用2 mL正己烷一次除脂后樣品液中脂肪層過厚、凈化液剩余量過少;用2 mL正己烷二次除脂和3 mL正己烷一次除脂的效果相當(dāng)，但二次除脂操作復(fù)雜耗時長。將該方法應(yīng)用于脫脂牛奶基質(zhì)的前處理，其凈化效果和回收率也可達(dá)到實(shí)驗要求。

2.1.3 濃縮條件的優(yōu)化

磺胺增效劑具有熱不穩(wěn)定性，濃縮時如果高溫加熱，雖能節(jié)省時間，但化合物被分解，回收率降低，得不償失，故加熱溫度不能設(shè)定太高。乙腈由于沸點(diǎn)較高，蒸發(fā)耗時較長，在溫度較低的情況下耗時更長。通過試驗比較，本實(shí)驗選用35℃為濃縮最佳溫度，既滿足回收率要求又最大限度地節(jié)省了時間。濃縮時不能過分蒸干，要及時觀察蒸發(fā)狀態(tài)，蒸發(fā)完畢后馬上定容，以免提取液濃縮后黏附于試管壁上難以溶解，導(dǎo)致回收率下降。

2.1.4 固相萃取凈化柱的選擇

本實(shí)驗以全脂牛奶等含乳量高的樣品的加標(biāo)回收試驗(加標(biāo)量為10 ng/mL)考察了PCX和MCX(美國Waters公司)、SCX(美國菲羅門公司)、HLB(美國Waters公司)4種固相萃取柱的凈化效果和回收效率。結(jié)果(見表3)顯示:PCX柱的保留較好，回收率良好。這是由于PCX柱是以聚苯乙烯-二乙烯苯為填料的萃取柱，該填料在酸性、中性、堿性中都很穩(wěn)定，屬于水可浸潤型聚合物，該萃取柱采用離子交換與反相保留雙重保留模式實(shí)現(xiàn)了良好的凈化效果和回收效率。而待測組分在HLB柱中基本不保留;在MCX、SCX柱中部分保留，回收率較低。故最終選用PCX作為固相萃取凈化柱。

表3 不同固相萃取柱對全脂牛奶中磺胺增效劑的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 3 R ecoveries and relative standard deviations of the sulfonamide potentiators in milk on different solid phase extraction columns(n=3)

2.2 UPLC條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的選擇

選擇甲醇為流動相的有機(jī)相是因為甲醇與乙腈相比極性較弱，當(dāng)流動相梯度條件相同時，甲醇可使3種磺胺增效劑的保留時間相對推后，同時甲醇會提高離子化程度，峰面積比以乙腈為流動相時大。選擇醋酸銨為流動相的水相可增加磺胺增效劑的保留性;加入少量甲酸可促進(jìn)電離，提高靈敏度。通過試驗比較，本實(shí)驗選擇流動相A為甲醇，B為5 mmol/L醋酸銨(含0.1%(v/v)甲酸)。

2.2.2 柱溫的選擇

考察了柱溫分別為35、40和45℃時3種磺胺增效劑靈敏度的差別，結(jié)果顯示隨著柱溫的升高，檢測靈敏度無明顯變化?？紤]到色譜柱在相對較低溫度下使用壽命較長，本實(shí)驗設(shè)定柱溫為35℃。

2.3 UPLC-MS/MS 分析

在優(yōu)化的UPLC-MS/MS條件下三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐胺嘧啶的保留時間為2.23、2.61和2.88 min。雞肉樣品中添加10.0 μg/kg 3種磺胺增效劑的MRM 譜圖見圖2。

圖2 加標(biāo)(10.0 μg/kg)雞肉樣品的UPLC-MS/MS MR M譜圖Fig.2 Chromatograms of a chicken sample spiked with the sulfonamide potentiator standards at 10.0 μg/kg by UPLC-MS/MS in MR M mode

2.4 基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限(LOQ)

實(shí)驗發(fā)現(xiàn)待測組分在基質(zhì)中受到的基質(zhì)干擾非常明顯。取空白樣品按1.4節(jié)進(jìn)行前處理，以此基質(zhì)提取液作稀釋液配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，與直接用定容液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液對比，基質(zhì)增強(qiáng)效率約為6倍。為扣除此基質(zhì)效應(yīng)，本實(shí)驗采用空白樣品配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取不同基質(zhì)的空白樣品進(jìn)行前處理，以基質(zhì)提取液作稀釋液配制混合標(biāo)準(zhǔn)曲線，以定量離子的峰面積對質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，在1.25～30.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.99)。在空白樣品中添加不同濃度的待測組分，前處理后按濃度由高至低檢測，直到獲得信噪比等于10(S/N=10)的濃度，確定定量限(LOQ)為 5.0 μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

表4為在空白試樣中進(jìn)行的添加回收率和精密度測定結(jié)果。在雞肉、魚肉、雞肝、雞蛋及牛奶樣品中分別添加 5.0、10.0、20.0 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合后靜置，使標(biāo)準(zhǔn)溶液被樣品充分吸收，然后按照本方法測定，每個添加水平測定6次，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

表4 各種基質(zhì)中3種磺胺增效劑的加標(biāo)回收率范圍和R SD(n=6)Table 4 R ecovery ranges and R SDs of the three sulfonamide potentiators spiked in different matrices(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了一種快速有效的多種動物源性食品中3種磺胺增效劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，獲得了滿意的分離效果和檢測靈敏度。該方法針對雞肉、魚肉、雞肝、雞蛋和牛奶等基質(zhì)嘗試了統(tǒng)一、簡單的前處理方法，對比固相萃取的凈化方式，在保證凈化效果的同時有效地提高了回收率。該方法的回收率、精密度和定量限均滿足殘留分析的要求。

［1］ Song W，Hu Y Y，Han F，et al.Chinese Journal of Chromatography(宋偉，胡艷云，韓芳，等.色譜)，2013，31(12):1161

［2］ Li B，Cheng H，Zhan C R.Physical Testing and Chemical Analysis Part B:Chemical Analysis(李兵，程慧，占春瑞.理化檢驗:化學(xué)分冊)，2010，46(11):1348

［3］ Commission Regulation(EC)No.1181/2002

［4］ NY 5070-2002

［5］ Gao J H，Lin P，Chen B.Analytical Laboratory(高建華，林鵬，陳彬.分析試驗室)，1999，18(6):37

［6］ Li H Y，F(xiàn)u G H.Shandong Pharmaceutical Industry(李華玉，伏光華.山東醫(yī)藥工業(yè))，1996，15(3):21

［7］ Wan Y P，F(xiàn)eng C W，Zhao Z M，et al.China Dairy Industry(萬宇平，馮才偉，趙正苗，等.中國乳品工業(yè))，2013，41(2):24

［8］ Liu Z W，Jiang Z X，Cao X，et al.China Animal Quarantine(劉振偉，姜兆興，曹旭，等.中國動物檢疫)，2010，27(5):36

［9］ Cheng L L，Zhang S X，Shen J Z，et al.Journal of Instrumental Analysis(程林麗，張素霞，沈建忠，等.分析測試學(xué)報)，2008，27(1):88

［10］ GB/T 21037-2007

［11］ Sayar E，Sahin S，Cevheroglu S，et al.Eur J Drug Metab Ph，2011，35(12):41

［12］ Du Y，Yang H Y，Xu W D.Journal of Pharmaceutical Analysis(杜玥，楊慧元，徐偉東.藥物分析雜志)，2010，30(3):471

［13］ Guo W，Liu Y，Liu N，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry(郭偉，劉永，劉寧，等.分析化學(xué))，2009，37(11):1638

［14］ Jiang Y，Shen C Y，Yao Y G，et al.Journal of Instrumental A-nalysis(蔣原，沈崇鈺，姚義剛，等.分析測試學(xué)報)，2009，28(7):834

［15］ Li H，Sun H W，Zhang J X，et al.J Food Control，2013，31:359

［16］ GB/T 22966-2008

［17］ SN/T 2312-2009

［18］ Wu Y L，Zhao L，Liu Y J，et al.Chinese Journal of Chromatography(吳銀良，趙莉，劉勇軍，等.色譜)，2007，25(5):728